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.2010年9月3日；285(36):28034-43.
doi:10.1074/jbc。M110.125336。 Epub 2010年7月8日。

雷帕霉素（mTOR）激活哺乳动物靶点增加受损周围神经的轴突生长能力

阿部纳美子 1, 史蒂文·博尔森, 迈克尔·甘贝洛, 范旺, 华利维亚·嘉华尼
附属公司

雷帕霉素（mTOR）激活哺乳动物靶点增加受损周围神经的轴突生长能力

阿部纳美子等。 生物化学杂志. .

摘要

与中枢神经系统（CNS）中的神经元不同，外周神经系统（PNS）中受伤的神经元可以再生轴突并使其目标重新神经化。然而，PNS的功能恢复通常仍不理想，尤其是在严重损伤的情况下。中枢神经系统神经元再生能力的缺乏与mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶点）通路的下调有关。我们在这里报道PNS背根神经节神经元（DRG）在损伤后激活mTOR，并且这种活动增强了轴突生长能力。此外，通过删除DRG中的结节性硬化复合物2（TSC2），基因上调mTOR活性，足以在体内外增强轴突生长能力。我们进一步表明，mTOR活性与GAP-43的表达有关，GAP-43是轴突生长的关键成分。然而，尽管DRG中TSC2缺失促进轴突再生，但它会导致靶神经支配的缺陷。因此，虽然操纵mTOR活性可以提供新的策略来刺激PNS中的神经再生，但要实现适当的靶神经支配，需要对mTOR活动进行精细控制。

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图1。
图1。
mTOR通路有助于增强外周神经损伤后的轴突生长能力。通过结扎诱导野生型小鼠坐骨神经损伤，并在指定的时间点评估L4、L5和L6 DRG细胞体中的S6磷酸化水平。A类在结扎后1至2天，DRG细胞体中S6磷酸化的时间进程显示S6磷酸化度增加。每个时间点显示一个代表性的Western blot。细胞色素c（c）(细胞色素c)用作加载控制。B类定量分析损伤和未损伤神经DRG细胞体之间S6磷酸化水平的变化，显示结扎后1天S6磷酸化度增加2倍，结扎后4天达到基础水平。S6磷酸化水平归一化为负荷控制。每个时间点至少测试四只小鼠。数据为平均值±S.E.*，第页<0.05（学生的t吨测试）。C类，量化通过腹腔注射雷帕霉素或二甲基亚砜处理的野生型小鼠培养的DRG的平均径向投影长度，然后进行坐骨神经结扎以引起损伤（详细信息见“实验程序”）。L4、L5和L6 DRG在4天后在NGF的存在下解剖和培养。从受损坐骨神经培养的DRG在培养24小时时显示出轴突生长增强。雷帕霉素部分阻断了这种作用(n个=每种情况4只小鼠）。每种情况下分析100–350个神经元。数据为平均值±S.E.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页<0.001（学生的t吨测试）。D类，如中所示C类，但一个代表性实验的损伤条件下DRG的径向投影长度分布直方图。E类，培养DRG的选定图像来自C类损伤条件下DRG的图像选自直方图的最右尾部，如D类。有关一组全面的图像，请参阅补充图1Axons用SMI-31抗体染色。酒吧，100微米。
图2。
图2。
TSC2KO DRG显示轴突生长增强在体外. A类来自TSC2KO和对照动物的DRG细胞体和脑裂解物的Western blot显示，TSC2蛋白水平在DRG中显著降低，但在大脑中没有降低。正如预期的那样，与对照动物相比，TSC2KO中S6磷酸化水平增加。显示了一个具有代表性的Western blot。B类，量化A类(n个=每个基因型5只小鼠）。数据为平均值±S.E.**，第页<0.01（学生的t吨测试）。C类，在NGF存在下，从TSC2KO小鼠和对照培养的幼稚和损伤条件下的DRG的平均径向投影长度的量化（详见“实验程序”）。TSC2KO DRG显示在无条件损伤的情况下轴突生长增强。分离前4天坐骨神经损伤不会进一步增加TSC2KO DRG的轴突生长(n个=每个基因型3只小鼠）。每个条件下分析60–370个神经元。数据为平均值±S.E。未注明日期。，无统计学显著差异。*，第页< 0.05; **,第页<0.01（学生的t吨测试）。D类，如中所示C类但一个代表性实验显示了培养的原始TSC2KO和对照DRG的径向投影长度分布直方图。E类，培养DRG的选定图像来自C类从其各自径向投影长度直方图的最右端选择天真和损伤条件TSC2KO DRG和损伤条件对照DRG的图像。一组全面的图像如所示补充图2Axons用SMI-31抗体染色。F类野生型DRG的放射投影长度无显著差异；阿德维林Cre公司/+小鼠和野生型培养的小鼠；阿德维林+/+老鼠(n个=每个基因型3只小鼠）。每个基因型测量100-200个神经元。数据为平均值±S.E。未注明日期。，无统计学显著差异（学生t吨测试）。酒吧，100微米。
图3。
图3。
TSC2KO DRG显示增强再生体内.对TSC2KO和对照小鼠进行坐骨神经挤压，12或24小时后评估挤压后轴突的再生。A类挤压后12或24小时解剖的坐骨神经纵切面显示，与对照组小鼠相比，TSC2KO小鼠挤压部位的GAP-43阳性轴突长度增加。A类虚线表示挤压位置。B类挤压后12和24小时，挤压部位远端不同距离处的GAP-43平均强度显示TSC2KO小鼠再生轴突的生长距离比对照组长。将GAP-43强度值标准化为压碎现场的强度值，以控制TSC2KO DRG中观察到的GAP-43表达水平增加。数据为平均值±标准偏差(n个=每个基因型3只小鼠）。每个小鼠在这两个时间点分析3-5个纵切面。C类，再生指数被测量为离开粉碎位点的距离，其中平均GAP-43强度是在粉碎位点观察到的强度的一半。与对照组相比，TSC2KO小鼠在12和24小时的时间点显示出更高的再生指数。*，第页< 0.05; **,第页<0.01（学生的t吨测试）。酒吧，200微米。
图4。
图4。
mTOR通路调节GAP-43的表达。 A类幼稚的TSC2KO DRG在培养中显示增强的细胞体和轴突GAP-43表达。箭头指示细胞体，以及箭头表示轴突尖端。B类采用轴切断法诱导TSC2KO和对照小鼠坐骨神经损伤，24h后用Western blot分析轴切断部位近端和远端神经部分以及对侧非损伤坐骨神经中GAP-43的水平。对照组小鼠在损伤部位附近的坐骨神经中GAP-43表达增加。TSC2KO小鼠GAP-43表达的基础水平和损伤诱导水平均增强。GAP-43水平标准化为负荷控制（微管蛋白）。数据为平均值±S.E(n个=每个基因型3只小鼠）。*，第页<0.05（学生的t吨测试）。C类，来自一个实验的代表性Western blot（每个基因型一只小鼠）B、D类，如中所示B类，但对DRG细胞体进行了分析。与对照组相比，TSC2KO小鼠DRG细胞体中GAP-43水平升高。在两种基因型中，轴突切断术均未增加DRG细胞体内GAP-43水平(n个=每个基因型3只小鼠）。**，第页< 0.01. （学生的t吨测试）。E类，来自一个实验的代表性Western blot（每个基因型一只小鼠）成本加运费，雷帕霉素阻断损伤后GAP-43表达的增加。给野生型小鼠腹腔注射雷帕霉素或二甲基亚砜载体对照品，然后结扎诱导坐骨神经损伤。结扎后4天，对结扎部位远端和近端的未封闭和结扎神经进行GAP-43表达分析。数据为平均值±S.E(n个=每种条件下3只小鼠）。*，第页< 0.05; *,第页<0.01（学生的t吨测试）。G公司，来自F.巴，100微米。美国。，任意单位；高膨胀率。，高暴露；低膨胀。，低曝光。
图5。
图5。
DRG中TSC2缺失并不影响外周蛋白或β-actin的表达。 A类通过轴切断术诱导TSC2KO和对照小鼠坐骨神经损伤。24小时后，用Western blot分析轴切开部位近端和远端神经部分以及对侧未损伤坐骨神经的外周蛋白和β-肌动蛋白水平。TSC2KO与对照组小鼠基础或损伤诱导的外周蛋白或β-肌动蛋白水平无显著差异。外周蛋白和β-肌动蛋白水平归一化为负荷控制（微管蛋白）。数据为平均值±S.E(n个=每个基因型3只小鼠）。未注明日期。，无统计学显著差异。B类，来自一个实验的代表性Western blot（每个基因型一只小鼠）交流，如中所示A类，但对DRG细胞体进行了分析。TSC2KO与对照组DRG中的外周蛋白和β-肌动蛋白水平无显著差异。数据为平均值±S.E(n个＝每个基因型3只小鼠）。D类，来自一个实验的代表性Western blot（每个基因型一只小鼠）加利福尼亚州，无轴切开；P（P），近端；D类，远端；美国。，任意单位。
图6。
图6。
TSC2缺失导致靶神经支配和轴突形态异常。 A类，用α-GAP-43染色后足爪glaborous皮肤切片，以显示支配皮肤的轴突末梢。红色虚线表示表皮层。低倍（15×）共聚焦图像显示，与对照组相比，TSC2KO小鼠穿透表皮层的轴突更少。高倍（60倍）共聚焦图像显示末端富集，分支过多(箭头)和急转弯(箭头)与对照组相比。Cre重组酶的存在与野生型的新生缺陷无关；阿德维林Cre公司/+小鼠与野生型无显著差异；阿德维林+/+室友或控制者。酒吧15×图像为200μm，60×图像为50μm。B类神经支配密度的量化显示TSC2KO小鼠皮肤神经支配的丧失。数据为平均值±S.E(n个=每个基因型3只小鼠）。每只小鼠分析17–56个切片。百分比的量化(C类)和编号(D类)分支过多的神经末梢（计算尖端有两个以上分支的轴突或90度转角的轴突），第页< 0.05;未注明日期。，无统计学显著差异（学生t吨测试）。E类轴突标记物SMI-31染色L5 DRG外周支横截面显示TSC2 KO与对照组之间轴突数量无显著差异。F类，量化E类. (n个=每个基因型3只小鼠）。每只老鼠分析两个部分。酒吧，100微米(E类).
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