Inactivation of hnRNP K by expanded intronic AUUCU repeat induces apoptosis via translocation of PKCdelta to mitochondria in spinocerebellar ataxia 10

doi:10.1371/journal.pgen.1000984

.2010年6月10日；6（6）：e1000984。

doi:10.1371/journal.pgen.1000984。

在脊髓小脑共济失调10中，通过扩增的内含子AUUCU重复序列失活hnRNP K通过PKCdelta向线粒体移位诱导凋亡

Misti C白色¹, 芮高, 徐伟东, 桑提·曼达尔, 郑国林, 塔帕斯·K·哈兹拉, Maki Wakamiya公司, 莎朗·爱德华兹, 萨尔莫·拉斯金, Hélio A G Teive公司, 胡达·Y·佐格比, 帕塔·S·萨卡, Ashizawa铁雄

附属公司

PMID： 20548952
预防性维修识别码：项目经理2883596
DOI（操作界面）： 10.1371/journal.pgen.1000984

在脊髓小脑共济失调10中，通过扩增的内含子AUUCU重复序列失活hnRNP K通过PKCdelta向线粒体移位诱导凋亡

Misti C白色等。公共科学图书馆-基因. 2010.

.2010年6月10日；6（6）：e1000984。

doi:10.1371/journal.pgen.1000984。

作者

Misti C白色¹, 芮高, 徐伟东, 桑提·曼达尔, Jung G Lim先生, 塔帕斯·K·哈兹拉, Maki Wakamiya公司, 莎朗·爱德华兹, 萨尔莫·拉斯金, Hélio A G Teive公司, Huda Y Zoghbi公司, Partha S Sarkar公司, Ashizawa铁雄

附属

¹美国德克萨斯州加尔维斯顿德克萨斯大学医学分院神经病学系。

PMID： 20548952
预防性维修识别码：项目经理2883596
DOI（操作界面）： 10.1371/journal.pgen.1000984

摘要

我们已经鉴定出染色体22q13.31上ATXN10内含子9内ATTCT重复序列的大量扩增是脊髓小脑共济失调10型（SCA10）的遗传突变。我们随后的研究表明，ataxin 10的功能增加或丧失都不可能是SCA10的主要致病机制。在这里，我们使用SCA10细胞、转染细胞和表达扩增内含子AUUCU重复序列的转基因小鼠大脑作为疾病模型，为SCA10的关键致病分子机制提供了证据。首先，我们通过原位杂交研究突变重复RNA的命运。Cy3-（AGAAU）（10）核糖探针检测到扩增的AUUCU重复序列聚集在SCA10细胞的病灶中。下拉和联合免疫沉淀数据表明，剪接内含子序列中扩增的AUUCU重复序列与hnRNP K强烈结合。hnRNP K的共扩增和转基因小鼠大脑和转染细胞中AUUCU重排聚集体证实了这种相互作用。为了研究这种相互作用对hnRNP K功能的影响，我们对hnRNP-K的一个分泌调节靶点进行了RT-PCR分析，发现SCA10细胞中的hnRNP K活性降低。表达扩增的AUUCU重复序列的细胞发生凋亡，伴随着PKCδ向线粒体的大量易位和胱天蛋白酶3的激活。重要的是，siRNA介导的hnRNP K缺乏也在其他正常细胞中引起了相同的凋亡事件，并且hnRNP K的过度表达挽救了表达扩增AUUCU重复序列的细胞免于凋亡，这表明hnRNP K的功能丧失在SCA10的细胞死亡中起着关键作用。这些结果表明，内含子RNA中扩增的AUUCU重复序列经历了正常的转录和剪接，但通过激活级联导致凋亡，包括hnRNP K活性的丧失、PKCdelta向线粒体的大量移位以及caspase 3的激活。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。扩增的AUUCU转录物形成离散聚集体。**
（A）鱼类SCA10成纤维细胞编码～2000个ATTCT重复，在细胞核、核边界和细胞质中显示多个明亮的RNA聚集体（箭头）。（B）鱼类与Cy3-标记（AGAAU）杂交的正常对照成纤维细胞₁₀探查。（C）包含人类的转基因结构示意图*烯醇化酶α*启动子，2^第兔子内含子*β-珠蛋白*基因，*LacZ公司*基因，内含子内克隆的扩展～500个ATTCT重复序列（或正常范围内的12个重复序列作为对照），以及牛生长激素（BGH）polyA序列。（D）鱼类在Sy5y细胞上，外源性表达内含子～500个AUUCU重复序列，来自图1C所示的转基因结构。图中显示了细胞核、核周和细胞质病灶（箭头所示）。（E）小鼠基因组DNA的梯形PCR分析显示存在扩增的ATTCT重复序列，1区：SCA10患者的阳性对照；泳道2：含有12个ATTCT重复序列的转基因小鼠，泳道3和4：编码约500个ATTCT重复序列的转基因小鼠。（F） Southern印迹*Xba公司*我-*Hin公司*dII消化了编码～500个ATTCT重复序列的转基因F1的基因组DNA（第2、3条通道）。通道1：野生型控制小鼠DNA。通道2和3：表达～500个ATTCT重复的转基因小鼠。Southern blot显示存在约500个ATTCT重复序列。基因内含子9的5′的DNA片段（～500 bp）*ATXN10型*基因被用作Southern探针。（G）鱼类野生型（左图）和编码约500个AUUCU重复序列的转基因小鼠大脑的矢状面切片（右图）。在本图和所有其他图中，条形代表10 mm。

**图2。扩增的AUUCU重复序列诱导细胞凋亡。**
（A）表达～500内含子AUUCU重复序列的Sy5y细胞的TUNEL分析。（B）表达12个内含子AUUCU重复序列的Sy5y细胞的TUNEL分析。（C）表达12个和～500个内含子AUUCU重复序列时发生凋亡的细胞百分比（n=6；p<0.0002）。（D）当Sy5y细胞表达12个和～500个AUUCU内含子重复（右栏）重复（*n=3，p<0.0001）时，显示Caspase-3活性作为相对荧光单位（RFU）的条形图。

**图3。扩增的AUUCU-RNA与hnRNP K结合。**
（A） PAGE显示了用生物素标记的AUUCU-RNA从小鼠脑提取物中提取的蛋白质。第1栏：分子量标记，第2栏：结合蛋白质*lacZ公司*具有12个AUUCU重复序列的转录本；通道3：与约500个AUUCU重复序列+lacZ转录物结合的蛋白质。质谱分析的唯一蛋白质带用箭头标记。（B）增加盐浓度时从RNA-蛋白复合物中提取的hnRNP K的Western blot分析。纯化的hnRNP K与单链（AUUCU）孵育₁₅RNA或对照RNA{（UUUCC）_三（中央控制单元）_三（UUUUC）_3}提取之前。顶部印迹是从（AUUCU）中提取的hnRNP K₁₅RNA-protein complex和bottom blot是从hnRNP K-control RNA complex中提取的hnRNP K组分。（C） RT-PCR分析来自正常（第1通道）和SCA10成纤维细胞提取物（第2通道）的RNA-Co-IP颗粒。来自SCA10成纤维细胞提取物的下拉IP显示存在内含子9序列*ATXN10型*基因。M=1 kb DNA梯形图。（D）鱼类野生型对照小鼠脑的矢状面。（E）鱼类显示内源性hnRNP K（绿色）与AUUCU RNA（红色）在表达约500个内含子AUUCU重复序列的SCA10转基因小鼠脑的矢状截面上的共同定位。（F）鱼类在Sy5y细胞上显示hnRNP K与扩增的AUUCU重复序列共定位。红色荧光：AUUCU RNA；绿色荧光：GFP标记的hnRNP K和黄色/橙色荧光：红色和绿色荧光的重叠（箭头）。（G） RT-PCR分析正常（第1通道）和SCA10（第2通道）成纤维细胞的总RNA，显示异常剪接*β-原肌球蛋白。*

**图4。靶向灭活*hnRNP K公司*引发细胞凋亡，而hnRNP K的异位表达可拯救AUUCU介导的细胞凋亡。**
（A） Western显示与对照siRNA和100pmoles siRNA转移72小时后Sy5y细胞中hnRNP K水平*hnRNP K公司*.β-肌动蛋白显示了控制。（B）用100pmoles处理后48和72小时，Sy5y细胞的胱天蛋白酶-3活性显示为相对荧光单位*hnRNP K公司*（*n=3，p<0.0001）和用对照siRNA处理72小时后。（C）TUNEL分析显示用对照和siRNA处理后Sy5y细胞凋亡的百分比*hnRNP K公司*（*n=6，p<0.0001）。（D） Sy5y细胞经100 pM（*n=3，p=0.0001）或200 pmoles si处理后，Caspase-3活性显示为相对荧光单位（RFU）*hnRNP K公司*与控制siRNA的100μmoles相比。（E）表达约500个AUUCU重复序列的Sy5y细胞的Caspase-3活性（黑色）；表达hnRNP K和～500 AUUCU重复序列的Sy5y细胞（灰色）。

**图5。PKCδ定位于SCA10成纤维细胞和转基因小鼠脑的线粒体。**
（A）正常成纤维细胞中的PKCδ（绿色）和线粒体（红色）。（B） SCA10成纤维细胞（点状聚集物）中的PKCδ（绿色），主要位于细胞核外。合并绿色（PKCδ与红色（线粒体）被视为黄色/橙色荧光。（C）表达12个ATTCT重复序列的对照转基因小鼠大脑皮层中的PKCδ（绿色）和线粒体（红色）。（D）表达约500个AUUCU重复序列的SCA10转基因小鼠皮层中的PKCδ（绿色）和线粒体（红色）。在SCA10转基因小鼠的皮层中，绿色（PKCδ）和红色（线粒体）的融合显示为黄色/橙色荧光。

**图6。靶向灭活*hnRNP K公司*在正常成纤维细胞或扩增的AUUCU-RNA的表达导致PKCδ的线粒体定位。**
（A）转染si的正常成纤维细胞中的PKCδ（绿色）和线粒体（红色）*hnRNP K公司。*红色和绿色荧光的合并可视为黄色/橙色荧光。（B）硅处理的正常成纤维细胞PKCδ（绿色）和线粒体（红色）控制注意，黄色/橙色荧光很小。（C）表达～500内含子AUUCU重复序列的成纤维细胞中的PKCδ（绿色）和线粒体（红色）。PKCδ和线粒体的共定域显示为黄色/橙色荧光。（D）表达内含子12个AUUCU重复序列的正常成纤维细胞中的PKCδ（绿色）和线粒体（红色）。条形代表10 mm in（A–D）。

**图7。下调*ATXN-10型*SCA10成纤维细胞减少线粒体中PKCδ的定位。**
（A）鱼类硅处理SCA10成纤维细胞的研究*ATXN10型*（左）和带有si控制（右）。（B）顶部面板：用si治疗72小时后SCA10成纤维细胞中的PKCδ（绿色）和线粒体（红色）*ATXN10型*中心面板：经si处理72小时后，SCA10成纤维细胞中的PKCδ（绿色）和线粒体（红色）控制，底部面板：人类对照成纤维细胞中的PKCδ（绿色）和线粒体（红色）。Bar代表10 mm。（C）示意图描述了SCA10的不同表型的可能机制。扩增的AUUCU-RNA结合导致hnRNP K功能丧失，可触发SCA10中的多种异常分子信号/过程。caspase-3的激活和PKCδ的断裂可能会导致神经元大量死亡。同时，hnRNP K功能的丧失或减弱可能导致多个基因的异常剪接、转录和翻译，从而导致SCA10中复杂的疾病表型。

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