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.2010年6月；9(6):1775-87.
doi:10.1158/1535-7163.MCT-09-1027。 Epub 2010年6月8日。

在缺乏DNA双链断裂修复的细胞中，聚ADP-核糖聚合酶抑制剂对辐射和烷基化试剂的敏感性增强

达娜·阿洛泽 1, 柴田厚司（Atsushi Shibata）, Akiko K Shibata公司, 丽莎·伍德宾, 佩妮A杰戈, 安东尼·查尔默斯
附属公司

在缺乏DNA双链断裂修复的细胞中，聚ADP-核糖聚合酶抑制剂对辐射和烷基化试剂的敏感性增强

达娜·阿洛泽等。 摩尔癌症治疗. 2010年6月.

摘要

作为单一药物，聚ADP核糖聚合酶（PARP）的化学抑制剂无毒，对BRCA1和BRCA2缺陷型肿瘤具有临床疗效。PARP抑制剂还可以增强电离辐射和烷基化剂的细胞毒性，但如果肿瘤致敏作用超过对正常组织的影响，则只能改善临床结果。目前尚不清楚肿瘤DNA修复能力如何影响致敏程度。我们之前已经证明，PARP抑制的放射增敏作用需要DNA复制，因此对快速增殖的肿瘤的影响将大于正常组织。由于许多肿瘤表现出DNA修复缺陷，我们研究了双链断裂（DSB）修复完整性对PARP抑制剂olaparib致敏作用的影响。DSB修复缺陷细胞对电离辐射和烷基化剂甲基甲烷磺酸盐的致敏作用增强。在Artemis（-/-）和ATM（-/--）小鼠胚胎成纤维细胞中，致敏是复制依赖性的，与复制相关损伤的修复缺陷相关。连接酶IV（-/-）小鼠胚胎成纤维细胞的放射增敏与DNA复制无关，可通过抑制“选择性”末端连接来解释。甲基甲烷磺酸盐处理后，PARP抑制促进了DSB的复制非依赖性积累，修复需要连接酶IV。我们的研究结果预测，与正常组织相比，PARP抑制剂在快速分裂和/或DNA修复缺陷肿瘤中的致敏作用将更加显著，并显示出其提高常规DNA损伤剂的治疗率的潜力。

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数字

图1
图1
答：。MEF指数期人群中细胞周期G1期、S期和G2期细胞的平均百分比。细胞固定并用碘化丙啶染色，用于流式细胞术分析DNA含量。B。重量，自动取款机−/−,阿耳特弥斯−/−和连接酶IV−/−第53页−/−MEF在用10 mM H治疗前用0.5μM olaparib预处理2小时2O（运行）2（添加或不添加0.5μM olaparib）在黑暗中放置10分钟。细胞被染色为多聚ADP-核糖（pAR），并用DAPI进行复染。使用NIH Image-J量化每个细胞核中pAR信号的荧光强度。给出了100-200个细胞+/-SD的平均值。C、。WT指数期种群的克隆存活率，自动取款机−/−,阿耳特弥斯−/−和连接酶IV−/−第53页−/−MEF在电镀后以指定剂量暴露于奥拉帕林24小时。D。WT的克隆存活，自动取款机−/−,阿耳特弥斯−/−和连接酶IV−/−第53页−/−在试验期间持续暴露于奥拉帕尼的MEFs。为了维持奥拉帕林的水平，每48小时更换一次培养基*第页<0.01 (自动取款机−/−与WT相比，阿耳特弥斯−/−和连接酶IV−/−第53页−/−每剂量奥拉帕林）。
图2
图2
WT指数期种群的克隆存活率，自动取款机−/−,阿耳特弥斯−/−和连接酶IV−/−第53页−/−MEF处理答：。37°C+/-0.5μM olaparib下MMS 1小时，治疗前、治疗中和治疗后21小时B。250 kV X射线+/-0.5μM olaparib，照射前2小时和照射后22小时。C、。指数型HeLa细胞照射前2小时和照射后22小时暴露于0.5μM olaparib和/或10μM ATM抑制剂KU55933的克隆存活曲线。
图3
图3
资产负债表。根据MEF暴露于0.5μM olaparib和/或5μM aphidicolin（APH），在250 kV X射线照射前1小时和照射后2小时得出的克隆存活曲线。答：。WT MEF、，B。 阿耳特弥斯−/−MEF、，C、。 自动取款机−/−MEF、，D。 连接酶IV−/−第53页−/−MEF公司。
图4
图4
答：。S期WT或阿耳特弥斯−/−MEF公司。在用MMS治疗之前（0.1 mM，1小时），将细胞暴露于0.5μM olaparib 1小时，直到在所示时间点固定。B类.S相WT中γH2AX信号的定量分析或阿耳特弥斯−/−MEF公司。根据3个实验得出的每个核的平均荧光强度+/-SEM，每个时间点至少25个核*第页<0.05.C、。G2期WT和G2期HT中γH2AX和磷甾酮H3免疫荧光的代表性图像阿耳特弥斯−/−MMS+/-奥拉帕林治疗24小时后的MEF答：。斑点p-组蛋白H3染色鉴定G2期细胞。D类MMS治疗+/-奥拉帕林24小时后G2期细胞中γH2AX信号的定量分析*第页<0.05.
图5
图5
答：。定量分析暴露于10μM PJ-34（PARP抑制剂）的成纤维细胞系的G1期48BR hTERT（野生型）、CJ176 hTERT和AT5-BIVA hTERT中的γH2AX病灶，预辐射1小时（3 Gy，γ射线），用3μM蚜虫灵处理，然后固定并共染γH2AX和CENP-F。B。暴露于10μM PJ-34照射前1小时（3 Gy，γ射线）的G1期MEFs中γ-H2AX病灶的定量分析，固定并染色γ-H2AX和磷酸组蛋白H3。排除磷酸化氢染色鉴定的G2细胞和背景γ-H2AX染色鉴定的S期细胞*第页<0.05, **第页与未使用PARP抑制剂的细胞相比，<0.01。
图6
图6
答：。定量分析G1期48BR原代和1BR hTERT成纤维细胞中的γH2AX病灶，在以指定剂量进行MMS治疗之前，暴露于10μM PJ-34 1小时。B-E.公司。48BRγH2AX病灶的定量分析(B类),连接酶IV−/−第53页−/−MEF公司(C类)，CJ176（Artemis缺乏）(D类)和HSC62（BRCA2缺陷）(E类)原代成纤维细胞系，在用1 mM MMS诱导损伤之前和期间，暴露于10μM PJ-34 1小时，并达到指定的修复期。固定细胞，并对其进行γH2AX和CENP-F或磷酸氢istone H3的联合染色*第页<0.05, **第页<0.01, ***第页对于用PARP抑制剂处理或未用PARP抑制剂处理的细胞之间的比较，<0.001。典型图像如补充图S5所示。
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