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.2010年6月9日；11(6):467-78.
doi:10.1016/j.cmet.2010.04.005。

肥胖患者肝脏自噬缺陷促进内质网应激并导致胰岛素抵抗

凌阳 1, 李萍, 苏能付, Ediz S Calay公司, 哥汗·S·霍塔米斯利吉尔
附属公司

肥胖患者肝脏自噬缺陷促进内质网应激并导致胰岛素抵抗

凌阳等。 单元格元. .

摘要

自噬是一个稳态过程，涉及细胞质成分的大量降解，包括受损的细胞器和蛋白质。在肥胖的遗传和饮食模型中，我们观察到自噬严重下调，特别是在肝脏中的Atg7表达水平。Atg7在体外和体内的抑制导致胰岛素信号传导缺陷和内质网应激升高。相反，在肥胖小鼠中，肝脏中Atg7表达的恢复导致内质网应激减轻、肝脏胰岛素作用增强和全身糖耐量增加。通过阻断下游介质Atg5，可以完全阻止肥胖小鼠恢复Atg7的有益作用，支持其在调节胰岛素作用时依赖自噬。我们的数据表明，自噬是细胞器功能和胰岛素信号的重要调节器，而自噬的丧失是肥胖患者胰岛素功能缺陷的关键组成部分。

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数字

图1
图1。肥胖患者自噬的调节
A类在肥胖患者的肝组织中检测自噬和内质网应激指标(对象/对象)通过westernblot分析，小鼠和年龄和性别匹配的瘦肉对照组。通过LC3-I转化为LC3-II、Beclin 1、Atg5、Atg7和p62蛋白的表达作为标记物来评估自噬。内质网应激通过IRE1和PERK的磷酸化进行检测（箭头表示磷酸化PERK）。B类.瘦鼠和肥胖鼠肝脏的代表性电子显微照片（9690×）。右侧显示的图片是左侧面板上用红色矩形标记的字段的高倍放大（57800×）。C类EM图像中每个场自噬体样空泡的定量。天检查肥胖小鼠肝脏中的自噬标记物及其停食后的年龄和性别匹配的瘦肉对照。E类在存在或不存在氯喹的情况下，表达GFP-LC3的瘦鼠和肥胖鼠肝脏中GFP-LC2点状结构的代表性图片。红色箭头表示GFP-LC3点状结构；细胞核用蓝色DAPI染色。F类.量化每个细胞的GFP-LC3点状结构。数据显示为平均值±SEM。星号表示由学生的t吨试验（*p＜0.05）。所有小鼠均为雄性，年龄为12-16周。
图2
图2。瘦肉和肥胖小鼠肝脏中Atg7的调节
A类用Atg7、结合型Atg5和LC3转化作为自噬标记物，对用脂质输注或载体治疗5小时的野生型瘦小鼠（10周龄）的肝脏进行自噬检测。量化显示在右侧面板上。B类用定量RT-PCR检测经载体（n=3）或脂质输注（n=5）治疗5小时的瘦小鼠肝脏中编码Atg7、Atg5和Lamp2的mRNA。结果显示，脂质输注组的基因表达水平与载体对照组一致。C类在瘦小鼠（n=3）或对象/对象老鼠。结果显示，肥胖组的基因表达水平归一化为瘦对照组。天Calpain 2在小鼠肝脏中表达的代表性蛋白质印迹对象/对象小鼠（n=8）和瘦鼠（n=7）作为对照。底部显示了斑点的数量。E类.对象/对象小鼠注射Calpain抑制剂III（10mg/kg）、PD150606（10mg/kg），用western blot检测肝脏Atg7的表达。底部显示了斑点的定量，每个治疗组有4只小鼠。所有数据显示为平均值±SEM。星号表示由学生的t吨测试（*p<0.05）。
图3
图3。抑制自噬导致胰岛素信号受损
A类用50nM胰岛素刺激野生型（WT）、Atg7−/−或Atg5−/–MEF细胞。通过IR酪氨酸1162/1163（p-IR）和Akt丝氨酸473（p-Akt）磷酸化的western blot分析检测胰岛素受体信号，定量显示在右侧面板上。结果表明，与各组的基础水平相比，胰岛素的诱导作用增加了一倍。B类用腺病毒介导的对照shRNAi to LacZ（Ad-LacZ）或shRNAito Atg7（Ad-shAtg7）感染Hepa1-6细胞，滴度为2×10912孔板中每孔的vp/ml。48小时后，用10nM胰岛素（In）刺激细胞3分钟，用western blot分析检测胰岛素受体信号。量化显示在右侧面板上。结果表明，与各组的基础水平相比，胰岛素的诱导作用增加了一倍。星号表示由学生的-t吨测试（*p<0.05）。
图4
图4。自噬缺陷导致胰岛素抵抗
A类瘦小鼠的肝脏胰岛素作用体内用shRNAi敲除Atg7。用Ad-LacZ或Ad-shAtg7注射瘦身小鼠（雄性，14周龄，C57BL/6J）。在肝脏注射胰岛素后，在完整的小鼠中检测胰岛素信号。数据的量化显示在右侧面板上，每个治疗组有4只小鼠的平均结果。结果表明，与各组的基础水平相比，胰岛素的诱导作用增加了一倍。数据显示为平均值±SEM。星号表示由学生的-t吨测试（*p<0.05）。B类Atg7敲除后瘦小鼠肝脏内质网应激的检测体内western blot分析检测到Chop、PERK和eIF2α磷酸化，并显示Atg7和微管蛋白作为对照。右侧面板上显示的数据的量化。结果表示通过Ad-shAtg7到Ad-LacZ在每个分子中的倍数变化。C类在Atg7敲除（n=8）后，对瘦小鼠（n=9）进行胰岛素耐受性试验。结果表示相对于起始值的血糖浓度。所有数据均以平均值±SEM表示，通过重复测量双向方差分析进行统计分析，然后进行后验（*表示p<0.05）。天在Atg7基因敲除后禁食6小时后，测量瘦小鼠的血清胰岛素水平。
图5
图5。重组Atg7恢复肥胖小鼠自噬和改善胰岛素作用
A类.自噬对象/对象腺病毒表达Atg7或对照载体（GFP）的小鼠。检测Atg7、Atg12-Atg5结合、Beclin 1表达、LC3转化和p62水平作为自噬标记。B类胰岛素刺激的IR酪氨酸1162/1163（p-IR）和Akt丝氨酸473（p-Akt）磷酸化对象/对象表达Atg7或对照载体（GFP）的小鼠。Atg7和微管蛋白用作对照。右侧面板中显示了数据的量化。结果表明，与各组的基础水平相比，胰岛素的诱导作用增加了一倍。C类PERK、eIF2α的磷酸化和HERP蛋白在小鼠肝脏中的表达对象/对象通过腺病毒传递表达Atg7或对照（GFP）蛋白的小鼠。Actin显示为一个控件，数据的量化显示在右侧面板中。结果显示Ad-Atg7到Ad-GFP每个分子的折叠变化。天用定量RT-PCR检测了小鼠肝脏中编码Grp78、Chop、PDI、Gadd34和ERdi4的mRNA对象/对象用Atg7重组小鼠。结果显示为Atg7组的基因表达水平归一化为对照组（GFP）。所有数据均显示为平均值±SEM。星号表示由学生的t吨测试（*p<0.05）。
图6
图6。肥胖小鼠肝脏Atg7修复的代谢效应
A类代表性肝脏的大体解剖图对象/对象表达Atg7（Ad-Atg7）或对照载体（Ad-GFP）的小鼠。B类H&E染色（40×）in的代表性图像对象/对象小鼠肝脏表达Atg7或对照载体。肝脏的甘油三酯（Tg）含量(C），血清胰岛素水平（D）测量单位为对象/对象表达Atg7（n=8）或对照载体（n=9）的小鼠。数据显示为平均值±SEM。星号表示由学生的-t吨测试（*p<0.05）。E类葡萄糖耐量试验（GTT）在对象/对象注射Adeno-GFP（Ad-GFP，n=8）或Adeno-Atg7（Ad-Atg7，n=9）的小鼠。F类.胰岛素耐受测试对象/对象注射Ad-GFP或Ad-Atg7的小鼠。所有数据均以平均值±SEM表示，通过重复测量双向方差分析进行统计分析（*表示p<0.05）。在对象/对象Ad-GFP转基因小鼠（n）=7）或Ad-Atg7(n个= 6). 基础和钳夹肝葡萄糖生成（HGP）（G–H），葡萄糖输注率（GIR）（一）腓肠肌的葡萄糖摄取（J）进行了分析。数据显示为平均值±SEM*P（P）< 0.05.
图7
图7。Atg7对肥胖小鼠全身胰岛素作用的自噬依赖性调节
葡萄糖（A）和胰岛素（B）公差测试对象/对象表达显性负性Atg5（DN-Atg5+GFP）、Atg7（Atg7+GFP。只有GFP病毒是控制因素。结果表示相对于起始值的血糖浓度。所有数据均以平均值±SEM表示，通过重复测量ANOVA进行统计分析，然后进行后验（*表示p<0.05）。每组包含8只9周龄的小鼠。C类胰岛素刺激的小鼠肝脏中IR酪氨酸1162/1163（p-IR）和Akt丝氨酸473（p-Akt）的磷酸化对象/对象表达GFP、Atg7+GFP、DN-Atg5+GFP或Atg7+DN-Atg5的小鼠。右边是面板C中显示的每个分子的定量。结果表明，与各组小鼠的基础水平相比，胰岛素的诱导倍数增加。数据显示为平均值±SEM。星号表示由学生的-t吨测试（*p<0.05）。
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