Bat3 promotes the membrane integration of tail-anchored proteins

doi:10.1242/jcs.066738

。2010年7月1日；123（第13部分）：2170-8。

doi:10.1242/jcs.066738。 Epub 2010年6月1日。

Bat3促进尾锚定蛋白的膜整合

帕维尔·列兹尼基¹, 安妮·克兰西, 布兰奇·施瓦巴赫, 斯蒂芬·高

附属公司

PMID： 20516149
预防性维修识别码：项目经理2886740
内政部： 10.1242/jcs.066738

Bat3促进尾锚定蛋白的膜整合

帕维尔·列兹尼基等。细胞科学杂志。 2010。

。2010年7月1日；123（第13部分）：2170-8。

doi:10.1242/jcs.066738。 Epub 2010年6月1日。

作者

帕维尔·列兹尼基¹, 安妮·克兰西, 布兰奇·施瓦巴赫, 斯蒂芬·高

附属

¹英国曼彻斯特牛津路曼彻斯特大学生命科学学院，M13 9PT。

PMID： 20516149
预防性维修识别码：项目经理2886740
内政部： 10.1242/jcs.066738

摘要

尾锚定蛋白在内质网（ER）的膜整合是翻译后的，不同的尾锚定蛋白质利用不同的细胞溶质因子。例如，哺乳动物TRC40在向内质网输送尾锚定蛋白的过程中具有明确的作用。尽管已知其等效酿酒酵母Get3与至少四种其他成分Get1、Get2、Get4和Get5（Mdy2）协同作用，额外的哺乳动物蛋白在尾锚定蛋白生物发生过程中的作用尚不清楚。为此，我们分析了Sec61beta的胞浆结合伴侣，Sec61beta是TRC40的一种明确的底物，并确定Bat3是一种以前未知的相互作用伴侣。Bat3耗竭抑制Sec61beta的膜整合，但不抑制第二个TRC40非依赖性尾锚定蛋白细胞色素b5的膜整合。因此，Bat3通过TRC40途径影响尾锚定蛋白的体外膜整合。当在缺乏尾锚定蛋白生物生成功能性GET途径的酿酒酵母中表达时，Bat3与由此产生的非靶向链的细胞溶质池相关联，并将其转移到细胞核。这种由Bat3介导的错误定位并不依赖于最近发现的酵母GET通路的一种成分Sgt2，我们建议Bat3要么在高等真核生物中调节TRC40通路，要么为新合成的尾锚定蛋白提供另一种命运。

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数字

**图1。**
**Sec61β-OPG膜整合需要胞浆和核苷酸三磷酸。**(A类)重组Sec61βOPG的膜整合反应在绵羊微粒体和兔网织红细胞裂解物（RRL）或缓冲对照物存在下进行。用识别OPG标签的单克隆抗体通过免疫印迹法分离和分析膜部分。标记Sec61βOPG的N-糖基化（+gly）和非糖基化形式。下积是Sec61βOPG的截短版本（补充材料图S1B，C）。(B类)三个50μl膜整合反应包含约1.1μM Sec61β-OPG和约2.1 OD₂₈₀/用EndoH处理和免疫印迹法对补充有越来越多兔网织红细胞裂解物（显示的总反应体积的%）的ml绵羊胰腺微粒体进行分析。(C类)如图所示，在存在或不存在能量再生系统的情况下，用未经处理的兔网织红细胞裂解物进行的标准膜整合反应。

**图2。**
**尾锚特异性细胞溶质因子的鉴定。**(A类)在UltraLink Biosupport上固定缺少跨膜结构域（−TMD）、全长Sec61β和RAMP4（补充材料图S1A）的Sec61β变体的可比数量的视蛋白表位标记版本（OPG），与兔网织红细胞裂解物孵育，结合伙伴用0.1%（v/v）洗脱Triton X-100经过大量清洗。SDS-PAGE和考马斯蓝染色后，进一步表征了车道2和3中强烈富集的成分。质谱成功鉴定的相关蛋白质显示为（*，**），其他候选蛋白质（？）保持不变。(B类)如图所示，通过免疫印迹法分析洗脱材料中的特定成分。

**图3。**
**Sec61β-OPG膜整合需要Bat3。**兔网织红细胞裂解物样品被Bat3或TRC40免疫抑制，使用适当的鸡或兔抗体进行平行对照免疫抑制，或完全不治疗，如图所示。(A类)上图中，不同网织红细胞裂解物制剂支持Sec61β-OPG膜整合的能力通过N-糖基化（+gly和−gly）与抗视蛋白单克隆抗体免疫印迹进行评估。在下面板中，网织红细胞裂解物未经处理，或按指示用越来越多的鸡抗Bat3 IgY抗体或对照鸡IgY进行处理，并使用二级抗体去除样本的免疫功能。如图所示，通过免疫印迹法测定产生的Bat3、TRC40、Hsp/Hsc70和SRP54水平。各个盒子显示一张胶片的一次曝光扫描。(B类)上面板，如A所述，确定了不同裂解液制剂支持Sec61β-OPG膜整合的能力。该面板显示了从一片胶片上进行的扫描，为了简单起见，将TRC40耗尽（通道2）和平行对照样品（通道3）分离开来，如垂直线所示。下面板中，TRC40和Bat3的水平与A相同(C类)对于A，测定了不同裂解物制剂支持Cytb5-OPG膜整合的能力。观察到少量SDS抗性Cytb5-OPG二聚体。在某些情况下，经过免疫耗竭的样品含有与第二抗体交叉反应的残余免疫球蛋白重链（标记的IgG）（见A和B，TRC40免疫印迹，白点）。还显示了使用TRC40血清观察到的一个小物种（B和C，TRC40面板，填充方形）。

**图4。**
**含有Bat3的组分恢复Sec61β-OPG膜整合。**(A类)如图所示，网织红细胞裂解物与不同的树脂孵育，并通过免疫印迹法测定各种细胞溶质因子的消耗。(B类)使用去树脂裂解液制剂刺激重组Sec61βOPG的膜整合(C类)回收与Cibacron Blue琼脂糖结合的材料，并通过免疫印迹法分析Bat3含量，并与同等数量的未处理裂解物和Cibacron-缺失裂解物进行比较，如图所示。3号车道是空的。(D类)重组Sec61β-OPG的膜整合是在存在未经处理的裂解液（通道1）、补充有缓冲液的西巴龙裂解液（区域2）或补充有西巴龙树脂洗脱液的西巴龙裂解液的情况下测定的（通道3）。如图3所示，每个盒子都代表一次曝光。

**图5。**
**Bat3和TRC40与不同群体的Sec61β-OPG多肽相关。**(A类)为了重述生物合成关联，Sec61β-OPG在兔网织红细胞裂解物中翻译，该材料通过5-25%蔗糖梯度离心，13个组分加上回收的颗粒（组分1=顶部，p=颗粒）。SDS-PAGE后，Sec61βOPG链的位置通过放射性标记链的磷光成像（上面板）确定，而各种细胞溶质因子的迁移通过免疫印迹（标记）确定。组分4-8中放射性标记的Sec61βOPG样品的畸变是由于用于体外翻译的裂解液中存在大量未标记的珠蛋白链所致。(B类)将每个蔗糖梯度部分的一部分与犬胰腺微粒体孵育，恢复膜，并通过磷光成像测定Sec61β-OPG的糖基化状态。估计每个单独部分产生的总N-糖基化物质的比例（总糖%），以提供膜整合的比较测量。

**图6。**
**Bat3在中重新调整GFP-Sed5酿酒酵母GET突变体。**(A类)全长Bat3（亚型2）的概述，以及本研究中使用的N末端片段。指出了泛素样结构域、NLS和BAG结构域以及抗体结合区的位置。在ΔNLS突变体中，显示的KRRK基序被改变为KRSL，以破坏Bat3的核靶向（Manchen和Hubberstey，2001）。(B类)免疫印迹显示野生型或Δ中的Bat3和磷酸甘油酸激酶1（Pgk1）水平*千年发展目标2*（Δget5）-转换*酿酒酵母*细胞。(C类)野生型表达全长Bat3的亚细胞定位*酿酒酵母*免疫荧光显微镜观察细胞核的DAPI染色。(D类-**H（H）**)Bat3表达对GFP-Sed5亚细胞定位的影响通过野生型的活细胞成像确定，Δ*获取3*, Δ*获得4*或Δ*千年发展目标2*（Δ*获得5*)单元格，如图所示。如图所示，使用全长Bat3，即N末端片段或ΔNLS突变体。参见补充材料图S2C，相同基因型的固定细胞和免疫染色细胞显示Bat3和GFP-Sed5免疫反应性与Δ中细胞核的DAPI染色共定位*千年发展目标2*(Δ*获得5*)单元格。比例尺：5μm。

**图7。**
**GFP-Sed5的Bat3重定标独立于中士2。**(A类)通过免疫印迹分析从含有或不含TA片段的重组TA蛋白中洗脱的网织红细胞裂解物成分（见图2）是否存在SGTA。(B类)野生型GFP-Sed5的活细胞成像，Δ*sgt2和Δmdy2sgt2酿酒酵母*表达全长人类蝙蝠3。(C类)TA蛋白、Bat3、SGTA/Sgt2、Hsp70和TRC40/GET途径成分之间潜在相互作用的总结（见Chang等人，2010；Corduan等人，2009；Costanzo等人，2010年；Favaloro等人，2008；Jonikas等人，2009年；Sasaki等人，2008年；Schuldiner等人，2008）；Stefanovic和Hegde，2007年；Stelzl等人，2005年；Winnefeld等人，2006年）。实线表示已知或假定的物理相互作用，虚线、调控相互作用和虚线表示Bat3对TA-蛋白生物发生的可能贡献。

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