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.2010年7月15日；29(28):4068-79.
doi:10.1038/onc.2010.177。 Epub 2010年5月24日。

质子辅助氨基酸转运蛋白是增殖和氨基酸依赖性mTORC1激活的保守调节因子

S海伯林 1, S卡齐, M H Ogmundsdóttir先生, E V Attwood公司, S卡拉, C A R博伊德, C威尔逊, D C I戈伯丹
附属公司

质子辅助氨基酸转运蛋白是增殖和氨基酸依赖性mTORC1激活的保守调节因子

S海伯林等。 癌基因. .

摘要

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt和雷帕霉素复合物1（mTORC1）信号级联的下游哺乳动物靶点促进正常生长，在肿瘤细胞中经常过度激活。mTORC1也受当地营养物质，特别是氨基酸的调节，但其机制尚不清楚。出乎意料的是，质子辅助氨基酸转运体（PAT或SLC36）家族成员从果蝇体内基因筛查中出现，作为对mTORC1介导的生长具有独特有效作用的转运体。在这项研究中，我们展示了两种在正常组织和癌细胞系中广泛表达的人类PAT，即PAT1和PAT4，当在果蝇中表达时，其行为类似于苍蝇PAT。小干扰RNA敲除表明，这些分子是激活mTORC1靶点和人类MCF-7乳腺癌和HEK-293胚胎肾细胞系增殖所必需的。此外，受氨基酸刺激的饥饿HEK-293细胞中mTORC1的激活需要PAT1和PAT4，并且在PAT1过度表达的细胞中升高。重要的是，在HEK-293细胞中，PAT1高度集中在细胞内隔间，包括内体，其中mTOR在氨基酸刺激下穿梭。因此，我们的数据与PAT调节mTORC1活性的模型一致，PAT不是通过将氨基酸运输到细胞中，而是通过调节细胞内对氨基酸的反应。

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图1
图1
人类PAT1和PAT4的活动与果蝇属苍蝇中的PAT。使用GMR-GAL4在眼睛的分化细胞中过度表达以下UAS-coupled转基因：苍蝇PAT路径从基因中的转座元件插入(路径GS13857标准; B） ，人类PAT1型（C） 和人类第四阶段（D） ●●●●。与非压力控制相比，所有措施都使商业规模适度但显著增加（A）。过度表达诱导的小脑损失狐狸从基因中的转座元件插入，狐狸GS9928标准,使用GMR-GAL4公司最清楚地看到的是眼睛的腹后边缘（E中的箭头）。苍蝇和人类PAT转运体（F-H）的共同过度表达增强了其表达。比例尺为100μm，适用于所有面板。面板A-D底部显示的全尺寸测量值，相对于对照的平均值±标准偏差；*P<0.001，n=6。
图2
图2
PAT1和PAT4都是MCF-7乳腺癌细胞正常增殖所必需的。siRNAs转染MCF-7乳腺癌细胞后的增殖mTOR公司（si825、si826和si827；A），PAT1型（si158、si159和si160；B）和第四阶段将（si435、si436和si437；C）与用干扰siRNA对照（sc）、仅脂质体™（lp）和非转染（nt）处理的对照细胞进行比较。最有效的组合PAT1型和第四阶段siRNA并没有进一步减少细胞数量（B）。条形图（D）显示了用最有效的siRNAs处理的样品在120小时时的细胞数mTOR公司（si827），PAT1型（si159）和第四阶段（si437）归一化为lp对照。误差线代表SEM。*P<0.0002：与lp控制相比减少。所有测量均在三份样品上进行，实验重复三次，结果相似。
图3
图3
PAT1和PAT4调节MCF-7乳腺癌细胞中mTORC1信号级联的活性。在含有10%血清的培养基中生长的MCF-7细胞的裂解物用siRNA处理120小时PAT1型（si158、si159和si160），第四阶段（si435、si436和si437）和mTOR公司通过用抗磷蛋白T389-p70 S6K1（P-T389-S6K1）和抗磷蛋白T24-FoxO1/T32-FoxO3a（P-FoxO1/3；a）、抗磷蛋白S240/244-S6（P-S240/244-S6）和抗磷蛋白S65-4E-BP1（P-S65-4E-BP1；B）进行探测，将（si825）与用打乱siRNA（sc）或仅脂质体™（lp）处理的细胞的对照裂解物进行比较，以及针对S6K1和4E-BP1的非磷特异性抗血清，以及用于确认等负荷的抗α-微管蛋白抗体。所有实验重复至少三次，结果相似。
图4
图4
PAT1位于MCF-7和HEK-293细胞内，调节细胞增殖。抗人PAT1的抗血清显示内源性PAT1蛋白在MCF-7（a）和HEK-293（B）细胞中的细胞质定位。过表达PAT1的HEK-293细胞利用该抗体产生更强烈的信号（C；与共焦图像中的B相比，检测增益降低），但蛋白质分布与内源性蛋白质模式非常相似。含有PAT1的结构经常被（上箭头）、重叠（下箭头）或邻近含有GFP-Rheb融合蛋白的区域包围，该融合蛋白以前被证明位于HEK-293细胞的晚期内体隔室周围（分别参见D和E中的低倍和高倍视图）。其他含有PAT1的细胞内结构可能代表早期内体或溶酶体区室，其中PAT位于其他细胞类型中。转染siRNA后HEK-293人胚胎肾细胞的增殖mTOR公司（si825和si827；F），PAT1型（si158和si159；G）和第四阶段将（si435和si437；H）与用干扰siRNA（sc）或仅用MATra试剂（MATra）处理的对照细胞进行比较。条形图（I）显示了用每个siRNA处理的样品在72小时时的细胞数，这些siRNA被归一化为sc对照。误差线代表SEM。*P<0.01**P<0.001；与MATra控制相比减少。所有细胞数测量均在三份样品上进行，实验重复三次，结果相似。
图5
图5
HEK-293细胞中正常mTORC1信号需要PAT1和PAT4。A.在含有10%血清的培养基中生长的HEK-293细胞在转染siRNAsPAT1型（si158和si159），第四阶段（si435和si437）和mTOR公司将（si825和si826）与用干扰siRNA（sc）或无siRNA（MATra）的磁辅助转染方案处理的细胞的对照裂解物进行比较。用抗磷蛋白-Tr-389-p70 S6K1（P-T389-S6K1）、抗磷蛋白-Ser-240/244-S6（P-S240/244-S6）、抗磷酸蛋白-S65-4E-BP1（P-S65-4E-BP1）、抗磷蛋白-T24-FoxO1/T32-FoxO3a（P-FoxO1/3a）、抗磷酸盐-S473-Akt（P-S473-Akt）抗体、抗S6K1、S6和4E-BPl的非磷特异性抗血清对斑点进行检测，以及抗α-微管蛋白抗体，以确认等负荷。所有实验重复至少三次，结果相似。根据三个独立实验中产生的印迹进行的强度测量表明，S6K1（B）、S6（C）和4E-BP1（D）的激活显著降低PAT1型,第四阶段和mTOR公司击倒*P<0.05**P<0.001。
图6
图6
PAT1和PAT4是饥饿的HEK-293细胞中氨基酸正常激活mTORC1信号级联所必需的。A.HEK-293细胞在含有10%血清的培养基中培养72小时，然后用siRNA转染PAT1型（si158和si159），第四阶段（si435和si437），mTOR公司（si825和si826）、扰乱的siRNA（sc）或暴露于不含siRNA的MATraA（MATra）之后。将它们饿死血清和氨基酸50分钟，然后暴露于氨基酸30分钟。通过用抗磷酸-Thr-389-p70 S6K1（P-T389-S6K1）、抗磷酸-Ser-240/244-S6（P-S240/244-S6，抗磷酸Ser-65-4E-BP1（P-S65-4E-BP 1）、抗磷酸Ser-473-Akt（P-S473-Akt）抗体、抗S6K1、S6和4E-BP的非磷酸特异性抗血清，以及抗α-微管蛋白抗体，以确认等负荷。所有实验重复至少三次，结果相似。根据三个独立实验中产生的印迹进行的强度测量表明，S6K1（B）、S6（C）和4E-BP1（D）的激活显著降低PAT1型,第四阶段和mTOR公司击倒*P<0.05**P<0.001。（E） 用空载体和PAT1过表达载体稳定转染HEK-293细胞，在含有10%血清的培养基中培养72小时，不需要血清和氨基酸。然后将培养物暴露于含有氨基酸的培养基或饥饿培养基中再30分钟。用上述抗体对这些细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。所有实验都重复了至少三次，结果相似。（F） 在48小时的时间过程中，将PAT1过度表达细胞的增殖与非过度表达细胞进行比较（n=6）*P<0.001，增殖明显大于非受压细胞。
图7
图7
解释PAT对mTORC1信号传导和增殖影响的模型。我们已经证明，PATs调节mTORC1对HEK-293细胞中胞外氨基酸的反应，尽管此过程中的关键PATs之一PAT1在细胞内富集。我们认为，这些细胞内PAT可能影响晚期内体中mTORC1的信号传导，mTOR在氨基酸刺激下被转运到这些内体中。它们可能通过转运依赖或受体机制发挥作用，与其他mTOR调节蛋白形成复合物，也可能是参与此过程的一系列内体复合物之一的成分。激活S6K1的细胞质亮氨酸可能与PAT的细胞质表面结合，以增强其激活mTORC1的能力。Rag GTPase需要在氨基酸刺激下将mTOR穿梭到含Rheb的内质体隔室，但酵母中的证据表明，它们也可能与氨基酸转运蛋白结合并促进其穿梭。因此，PAT依赖Rag穿梭到内体可能是mTOR调控的一个关键方面。
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    1. Avruch J、Long X、Ortiz-Vega S、Rapley J、Papageorgiou A、Dai N。TOR复合物1的氨基酸调节。美国生理内分泌代谢杂志。2009;296:E592–602。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bermingham JR，JR，Pennington J.氨基酸转运蛋白基因SLC36簇的组织和表达。哺乳动物基因组。2004;15:114–125.-公共医学
    1. Beugnet A、Tee AR、Taylor PM、Proud CG。通过细胞内氨基酸可用性调节mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶点）信号传递。生物化学杂志2003；372:555–566.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Boll M，Foltz M，Rubio-Aliaga I，Kottra G，Daniel H.两种新型哺乳动物电致质子依赖性氨基酸共转运体的功能表征。生物化学杂志。2002;277:22966–22973.-公共医学

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