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.2010年7月；30(14):3480-92.
doi:10.1128/MCB.00057-10。 Epub 2010年5月10日。

Pref-1与纤维连接蛋白相互作用抑制脂肪细胞分化

王玉辉 1, 赵玲（Ling Zhao）, 辛西娅·斯马斯, 南喜树
附属公司

Pref-1与纤维连接蛋白相互作用抑制脂肪细胞分化

王玉辉等。 分子细胞生物学. 2010年7月.

摘要

Pref-1/Dlk1是一种表皮生长因子（EGF）重复性跨膜蛋白，但被肿瘤坏死因子-α转化酶（TACE）裂解，生成具有生物活性的可溶性形式。可溶性Pref-1通过激活细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）和随后上调Sox9表达来抑制脂肪细胞分化。然而，其他人在Pref-1信号和功能中暗示了Notch。这里，我们表明Pref-1不与Notch交互，也不需要Notch来实现其功能。相反，我们显示了Pref-1和纤维连接蛋白通过Pref-1膜旁结构域和纤维连蛋白C末端结构域直接相互作用。我们还表明，纤维连接蛋白是Pref-1介导的脂肪细胞分化抑制、ERK/MAPK激活和Sox9上调所必需的。此外，通过添加RGD肽或敲除α5整合素来破坏纤维连接蛋白与整合素的结合，可以防止Pref-1抑制脂肪细胞分化。Pref-1激活整合素下游信号分子FAK和Rac，而Pref-1对ERK的激活被Rac的击倒或显性负Rac的强制表达所减弱。我们的结论是，通过与纤维连接蛋白的相互作用，Pref-1激活整合素下游信号，激活MEK/ERK并抑制脂肪细胞分化。

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图1。
图1。
Pref-1不与Notch相互作用，也不需要Notch进行信号传导。（A） 将COS-7细胞与Notch、Dll-HA、去胡桃素-HA和Pref-1 EC-HA共转染。细胞裂解物用对照IgG或抗-HA琼脂糖珠进行免疫沉淀（IP），然后用抗Notch抗体进行Western印迹。（B） 用1μMγ-分泌酶抑制剂L-685458（Tocris Bioscience）处理3T3-L1细胞24小时，血清饥饿4小时，然后用50 nM hFc或Pref-1-hFc处理15分钟。使用抗磷酸化ERK1/2进行Western blotting，显示总ERK1/2抗体。用对照或Notch siRNA转染3T3-L1细胞。转染48小时后，用hFc或Pref-1-hFc处理细胞。使用抗Notch、磷酸化ERK1/2和总ERK1/2抗体进行蛋白质印迹。（C） 3T3-L1细胞在1μMγ-分泌酶抑制剂L-685458存在下或在Notch siRNA转染后Pref-1-hFc存在下接受脂肪细胞分化。显示油红O染色（上部）、脂质染色定量（左下方）和RT-qPCR脂肪细胞标记物表达水平（右下方）。
图2。
图2。
Pref-1与纤连蛋白相互作用。（A） 在酵母双杂交试验中，Pref-1JM与C末端纤维连接蛋白相互作用（左）。用指示质粒双重转化酵母平板的过滤复制品的β-半乳糖苷酶活性染色。1106A，阳性克隆；Pas2，空向量。所用纤维连接蛋白结构和纤维连连接蛋白片段的示意图（右侧面板）。（B） COS-7细胞与Pref-1-HA和52Fn-Myc共转染，裂解产物进行IP，然后进行Western blotting。（C） 通过Pref-1-HA珠下拉52Fn-Myc。将转染52Fn-Myc的COS-7细胞的裂解液用于Pref-1-HA珠的下拉，并通过Western blotting（IB）进行检测。星号代表IgG带。（D）35在SDS-PAGE和放射自显影之前，先培养S标记的Pref-1JM-HA和52Fn，然后用HA抗体进行IP。（E） 纯化的Pref-1EC在IP前与纯化的纤维连接蛋白片段一起孵育，然后使用抗Pref-1抗体或正常IgG，随后使用抗纤维连连接蛋白抗体进行Western印迹。（F） 通过SDS-PAGE分离的纤连蛋白片段在与Pref-1EC或Pref-1JM-AP孵育之前转移到硝化纤维素上。（G） 将Myc-tagged FnI或FnII转染到COS-7细胞中，并用裂解产物与Pref-1EC-HA珠进行下拉试验。星号代表IgG带。
图3。
图3。
Pref-1与纤维连接蛋白在脂肪细胞分化调控中的关系。（A） 3T3-L1脂肪细胞分化过程中不同基因和蛋白质的半定量RT-PCR和Western blotting。（B） Pref-1和纤维连接蛋白定位的免疫荧光显微照片。以山羊抗Pref-1抗体作为第一抗体对3T3-L1细胞进行免疫染色，并用抗山羊IgG-Alexa荧光488（绿色）标记。这些细胞还用小鼠抗纤维结合蛋白抗体染色，并用抗小鼠IgG-Alexa荧光594（红色）标记。DAPI染色（蓝色）也显示出来。（C） 将Pref-1EC和52Fn-Myc转染到COS-7细胞（左）中，并在分化过程中将收集的条件培养基添加到3T3-L1细胞中。油红O染色（右上面板）及其定量（右下左面板）如图所示。结果为平均值±SEM。对照细胞分化后的强度定义为1。P（P）<0.05（*）和P（P）与对照细胞相比<0.01（**）。显示脂肪细胞基因表达的半定量RT-PCR。
图4。
图4。
纤维连接蛋白是Pref-1抑制脂肪细胞分化所必需的。（A） 转染纤维连接蛋白或对照siRNA的3T3-L1细胞在hFc或Pref-1-hFc存在下接受脂肪细胞分化。显微镜形态（上部）、油红O染色和脂质积聚定量（中部）显示。RT-qPCR和半定量RT-PCR也显示在底部。分化后用hFc处理的对照siRNA-转染细胞的值定义为1。P（P）<0.05（*）和P（P）与对照细胞相比<0.01（**）。（B） 用对照或纤维连接蛋白siRNA转染Pref-1空MEF，并用Pref-1-hFc处理。用抗纤维结合蛋白、磷酸化ERK1/2和总ERK1/2抗体进行蛋白质印迹（左）。对照细胞或纤维连接蛋白siRNA-转染细胞经hFc或Pref-1-hFc处理8小时，然后通过Western blotting检测Sox9蛋白水平（右）。（C） 用纤维连接蛋白siRNA和1.0 kb C/EBPβ启动子-荧光素酶构建物（左）或2.0 kb C/EBPδ-启动子-萤光素酶构造物（右）转染3T3-L1细胞。48 h后，用对照hFc或Pref-1-hFc处理细胞额外16 h。使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）测量荧光素素酶活性。内部控制采用pRL-SV40。结果为平均值±SEM。**，P（P）< 0.01. 无显著差异。
图5：。
图5：。
α5整合素是Pref-1抑制脂肪细胞分化所必需的。（A） 3T3-L1细胞在对照DGR或RGD肽和hFc或Pref-1-hFc的存在下分化。通过RT-qPCR和RT-PCR显示了形态学和脂肪细胞标记物的表达水平。分化后用DGR肽和hFc处理的细胞的值定义为1。P（P）<0.05（*）和P（P）与对照细胞相比<0.01（**）。（B） RT-PCR证实了3T3-L1细胞中α5整合素的敲除（左）。用对照或α5整合素siRNA转染的细胞在hFc或Pref-1-hFc的存在下进行脂肪细胞分化。显微镜形态、油红O染色（中间）和RT-qPCR表达水平（右侧）如图所示。**，P（P）与对照细胞相比<0.01。
图6。
图6。
参与Pref-1激活ERK的下游信号通路。（A） 用hFc或Pref-1-hFc处理3T3-L1细胞1小时。显示蛋白质印迹。（B） 用Pref-1-hFc处理稳定表达对照GFP或显性阴性Rac（RacDN-GFP）的细胞。用抗GFP、磷酸化ERK1/2和总ERK1/2抗体进行Western blotting（左）。显示了油红O染色和RT-qPCR测定的脂肪细胞标记物表达水平。首次用对照GFP载体转染的细胞或分化后用对照hFc处理的细胞的值定义为1。P（P）<0.05（*）和P（P）与对照细胞相比<0.01（**）。（C） 使用所示抗体对转染对照或Rac siRNA、用hFc或Pref-1-hFc处理的3T3-L1细胞的裂解物进行Western blotting。通过RT-qPCR显示油红O染色和脂肪细胞标记物表达水平。用对照siRNA转染的细胞或分化后用对照hFc处理的细胞的值定义为1。P（P）<0.05（*）和P（P）与对照细胞相比<0.01（**）。
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