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.2010年7月1日；21(13):2257-69.
doi:10.1091/mbc.e09-11-0969。 Epub 2010年5月5日。

酿酒酵母自噬需要Golgi-Sec后蛋白

耿洁菲 1, 乌沙·奈尔, Kyoko Yasumura-约里米松, 丹尼尔·克林斯基
附属公司

酿酒酵母自噬需要Golgi-Sec后蛋白

耿洁菲等。 分子生物学细胞. .

摘要

在真核细胞中，自噬介导细胞溶质内容物的降解以响应环境变化。真菌的遗传分析已经鉴定了30多个自噬相关（ATG）基因，并为这一过程的分子机制提供了实质性的见解。然而，一个尚未解决的基本问题是形成自噬体的脂质的来源，自噬是一种对自噬至关重要的隔离囊泡。在这里，我们报告了两种高尔基后蛋白，Sec2和Sec4，是自噬所必需的。Sec4是Rab家族的GTPase，Sec2是其鸟嘌呤核苷酸交换因子。在sec2和sec4条件突变酵母中，Atg9（一种拟议的膜载体）的顺行运动在饥饿条件下受到破坏。同样，在sec2突变体中，Atg8被无效地招募到吞噬细胞组装位点，该位点参与自噬体的生物发生，导致自噬小体的生成减少。我们认为，在自噬诱导后，Sec2和Sec4的功能被转移，以引导膜流形成自噬体。

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图1。
图1。
Sec2参与自噬和Cvt途径。（A） GFP-Atg8处理在中被阻止秒2突变体。GFP-Atg8通过野生型染色体整合表达（JGY146），第2-59秒（JGY183），以及秒2-41（JGY184）株。细胞在24°C至中期的YPD中培养。对于每个菌株，培养物被分为两部分。一人在37°C下孵育30分钟，以灭活秒2突变体，而另一个保持在24°C。然后将细胞移到SD-N并在相同温度下培养2h。在饥饿前后采集样本。为了恢复（R），将在37°C下饥饿2 h的细胞移回24°C，再饥饿2 h。用抗YFP抗体（识别GFP）进行免疫印迹，并显示全长GFP-Atg8和游离GFP的位置。（B） Sec2的外源性表达恢复了第2-59秒突变体。第2-59秒携带空载体或pCuSec2（416）的GFP-Atg8细胞（JGY183）在SMD培养基中培养，并按A（C）所述进行检测秒2突变株在37°C饥饿2小时后仍能存活。将相同数量的饥饿细胞从A中稀释并置于YPD板上，然后在室温下进行2-d培养。细胞从左到右每一步稀释1:5。（D） Pho8Δ60活性第2-59秒突变体。野生型（TN124），atg1处Δ（HAY572），和第2-59秒（JGY112）电池以及第2-59秒表达空载体或pCuSec2（416）的细胞在A中培养。按照材料和方法中的描述进行Pho8Δ60分析。误差栏，三个独立实验的SD。与野生型或单独载体相比有显著差异，**p<0.01。（E） Cvt途径在第2-59秒突变体。野生型（SEY6210）和第2-59秒（JGY113）细胞在24°C的SMD中生长。在37°C下失活30分钟后，对细胞进行脉冲追踪标记，如材料和方法.
图2。
图2。
Sec2上的58-氨基酸结构域对其在自噬中的作用至关重要。（A） Sec2等位基因示意图。（B） 58-氨基酸结构域内的突变导致GFP-Atg8加工缺陷。野生型（JGY124），秒2-78（JGY125）和秒2(Δ451-508)用pGFP-Atg8（316）质粒转化（JGY126）细胞，并如图1A所示进行检测。（C） 自噬缺陷秒2-78和秒2(Δ451-508年)经Pho8Δ60分析证实。采用Pho8Δ60分析法检测B中使用的对应Pho8△60菌株（JGY127、JGY128和JGY129）。误差栏，三个独立实验的SD。与野生型相比有显著差异，**p<0.01。（D） Sec2的极端C终点对于补充第2-59秒突变体。第2-59秒用表达各种截断形式Sec2的质粒转化（JGY112）细胞，并通过Pho8Δ60检测。误差栏，三个独立实验的SD。与单独的载体相比有显著差异，**p<0.01；无显著差异，○p>0.1。
图3。
图3。
Sec2突变导致自噬体数量减少，但对其大小没有影响。灭活后，野生型(第四人民党Δ第4版Δ，143法国法郎），atg1处Δ (atg1处Δ第四人民党Δ第4版Δ，HCY76），以及第2-59秒(第2-59页第4页Δ第4版Δ，JGY180）菌株在37°C下饥饿2 h，然后按照以下所述进行EM分析材料和方法（A）野生型的代表性图像，atg1处Δ和第2-59秒菌株。比例尺，500 nm。（B和C）自噬体的数量和大小。量化如所述材料和方法误差线，SEM。
图4。
图4。
PAS中Atg8的招募受到影响第2-59秒突变体。（A和B）在鞋面3ts秒背景，第2-59秒细胞在胞浆中积累较少的GFP-Atg8点。预灭活后，蒸汽m3ts秒（JGY169）和蒸汽m3ts秒秒2表达染色体整合GFP-Atg8的突变体（JGY171、JGY172）在37°C下饥饿20分钟。固定细胞以避免GFP-Atg8的任何移动，并按照材料和方法.投影了十二个Z截面图像，以可视化整个细胞中存在的所有点。代表性图像显示在A中，GFP-Atg8点数量的量化显示在B中。误差栏，SEM；n=100。GFP-Atg8的（C–E）PAS强度在第2-59秒突变体，但有GFP-Atg8点的细胞较少。野生型（JGY146）和第2-59秒（JGY183）GFP-Atg8菌株在37°C的SD-N中孵育20 min，并用显微镜检查细胞。（C） 投影12张Z截面图片后的代表图像。（D） 测定至少有一个GFP-Atg8点的细胞百分比。误差栏，SD来自三个独立实验；n＝300。（E） GFP-Atg8的相对PAS强度。野生型细胞中的强度设置为100%，另一个值被归一化。误差棒，SEM；n=50。比例尺，5μm。
图5。
图5。
Atg9顺行运动在秒2突变体。（A） 在TAKA分析中，Atg9定位于秒2-41NPT突变。野生型（Atg9-3xGFP RFP-Ape1atg1处Δ，JGY197）和秒2-41突变体（Atg9-3xGFP RFP-Ape1atg1处Δ，JGY107）细胞在指示温度下饥饿2 h。固定细胞，然后进行显微镜分析。堆叠了12幅Z截面图像，并显示了具有代表性的图像。（B） 外源性Sec4表达可修复Atg9顺行运动缺陷秒2-41TAKA分析显示的细胞。秒2-41（Atg9-3xGFP RFP-Ape1atg1处Δ）细胞用空载体pSec2（413）或pSec4（413。制备显微镜样品，并按照2μm的A.比例尺所述进行拍照。
图6。
图6。
这个秒4突变体表现出自噬缺陷。（A） 两个第4节等位基因显示Pho8Δ60活性缺陷。这个秒4-2（JGY168）和秒4-8（JGY159）突变体和相应的野生型（JGY166，YTS158）菌株在24°C至中期的YPD培养基中培养。一半的培养物在34°C下被Sec4功能灭活30分钟，而另一半在24°C下保持生长。然后将细胞移到SD-N，并保持温度。在饥饿2小时前后收集样本。为了恢复，将34°C下饥饿的细胞移回24°C，再培养2 h。三次独立分析的误差棒SD。与相应的野生型细胞相比有显著差异，**p<0.01。（B） 秒4突变株在34°C饥饿2小时后仍能存活。相同数量的野生型（YTS158）和秒4-8在所示温度下饥饿2小时后，将（JGY159）细胞稀释并点在YPD板上。细胞从左到右每一步稀释1:5。将平板在室温下培养2 d。（C）Sec4S34N系列对自噬有显著的负作用。用表达Sec4或Sec4的空载体或质粒转化野生型细胞（TN124）S34N系列在CUP1大学发起人。将转化物培养在30°C的SMD培养基中，并转移到SD-N中培养2 h。饥饿前后，收集样品并通过Pho8Δ60分析进行测试。误差栏，三个独立分析的SD。与单独的载体相比有显著差异，**p<0.01；无显著差异，○p>0.1。（D） Atg9向PAS的移动在中有缺陷秒4-8突变体。秒4-8（附件9-3xGFP RFP-Ape1atg1处Δ，JGY198）细胞用于显微镜检查，程序与图5A中所述类似。比例尺，2μm。
图7。
图7。
在饥饿状态下，蛋白质分泌被下调。（A） 用于脉冲追逐实验的程序的示意图。（B） 细胞外介质的相对放射性。细胞在30°C的指定培养基中培养，除了秒2-41细胞，在37°C下追逐。在指定的时间点采集样本。沉淀细胞外蛋白，并使用闪烁计数器量化放射性量。时间零点的值被设置为1.0，其他值被规范化。误差栏，SD来自三个独立实验。（C） SDS-PAGE检测细胞外蛋白的分泌。在0、30和60分钟从B处采集的样品通过SDS-PAGE进行分离，并通过放射自显影术进行可视化。
图8。
图8。
巨噬细胞自噬缺陷和Atg8定位异常密码31/32ts秒突变体。（A） GFP-Atg8处理在密码31/32ts秒GFP-Atg8处理显示的突变。野生型（NSY128）和密码31/32ts秒用pGFP-Atg8（316）质粒转化的（NSY340）细胞在24℃的SMD中生长。在24或37°C培养后收集样品，并按照图1A所示进行检查。恢复（R）是指细胞在37°C培养后移回24°C。（B） Pho8Δ60测定密码31/32ts秒突变体。野生型（JGY220）和密码31/32ts秒（JGY209）细胞通过Pho8Δ60检测。误差栏，三个独立实验的SD。与野生型相比有显著差异，**p<0.01。（C和D）饥饿时，在密码31/32ts秒细胞。密码31/32ts秒第四人民党Δ第4版携带pCu416或pCuYpt31（416）的Δ（JGY222）细胞在24℃的SMD中培养。灭活30分钟后，细胞在NPT处饥饿2小时。制备EM样品，并对EM数据进行分析，如图3所示。（C） 具有代表性的EM图像。比例尺，500 nm。自噬体的数量被量化并显示在D.误差条、SEM（E和F）中密码31/32ts秒Atg8本地化有缺陷。野生型（JGY217），蒸汽m3ts秒（JGY227），以及密码31/32ts秒（JGY210）细胞在24°C的YPD培养基中培养，转移到37°C培养30分钟，然后在37°C饥饿。为了恢复对温度敏感的表型，蒸汽m3ts秒和密码31/32ts秒将细胞移回24℃，在YPD或SD-N培养基中再培养2 h。（E）典型荧光显微镜图像。液泡膜用FM 4-64染色，如材料和方法对于每种情况，只显示了一个具有明确定义的液泡的Z截面。比例尺，2μm。（F） 使用抗YFP抗体对在指定条件下采集的样品进行免疫印迹检测。（G） Ypt31/32不参与Atg9向PAS的移动。密码31/32ts秒（附件9-3xGFP RFP-Ape1atg1处Δ，JGY192）突变细胞使用TAKA分析进行检测，其过程与图5A所述类似。比例尺，2μm。
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