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.2010年7月2日；285(27):20964-74.
doi:10.1074/jbc。M109.094136。 Epub 2010年5月3日。

变构抗体抑制剂对赖氨酰氧化酶样2酶活性的调节

赫克托·罗德里格斯 1, 玛丽亚·维斯伯格, 阿曼达·米克尔, 斯科特·麦考利, 阿琳·C·维莱奥, 卡洛斯·加西亚, 维多利亚·史密斯
附属公司

变构抗体抑制剂对赖氨酰氧化酶样2酶活性的调节

赫克托·M·罗德里格斯等。 生物化学杂志. .

摘要

在本报告中，我们评估了赖氨酰氧化酶样2（LOXL2）对底物1,5-二氨基戊烷（DAP）、精胺和I型胶原的稳态酶活性。我们发现，DAP和精胺都能在相同程度上激活LOXL2，并且具有相似的米氏常数（K（m）约1mm）和催化速率（K（cat）约0.02s（-1））。我们还表明，LOXL2能够被赖氨酰氧化酶（LOX）的一种已知自杀抑制剂β-氨基丙腈抑制，我们发现它是LOXL2活性的一种有效抑制剂。还检查了β-氨基丙腈的抑制方式，发现其与底物DAP和精胺竞争。此外，我们鉴定了一种具有LOXL2酶功能的抗体抑制剂（AB0023），并发现这种抑制作用对精胺和DAP都是以非竞争的方式发生的。AB0023的结合表位被定位到人类LOXL2的清道夫受体富含半胱氨酸的结构域4。AB0023与远离催化结构域的区域结合，使AB0023成为LOXL2的变构抑制剂。这为AB0023提供了几个优点，因为它对LOXL2具有特异性，并以非竞争方式抑制LOXL2的酶功能，从而允许无论底物浓度如何抑制LOXL 2。这些结果表明，酶功能的抗体变构调节剂代表了一种新的药物开发策略，在LOXL2的背景下，这些抑制剂可能在肿瘤学、纤维化和炎症方面有用。

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数字

图1。
图1。
所用蛋白质的纯度。(A类)SDS-PAGE 4–12%，显示了本研究中使用的蛋白质的纯度。标记表示为M（M），分子量标记在相应的旁边乐队。车道1是hLOX，车道2是hLOXL1，车道3是hLOXL2，车道4为hLOXL3，并且车道5为hLOXL4。(B类)，蛋白质的Western blot显示于A类使用Arresto生产的抗LOXL2抗体（1μg/ml）进行探测。标记表示为M（M），分子量标记在相应的乐队。车道1是hLOX，车道2是hLOXL1，车道3是hLOXL2，车道4为hLOXL3，并且车道5为hLOXL4。(C)，蛋白质的Western blotA类用抗组氨酸抗体进行检测。标记表示为M（M），分子量标记在相应的旁边乐队。车道1是hLOX，车道2是hLOXL1，车道3是hLOXL2，车道4为hLOXL3，并且车道5为hLOXL4。
图2。
图2。
在底物浓度范围内测量1,5-二氨基戊烷（○）和精胺（●）的稳态酶速率。稳态值k个猫和K（K）米通过拟合数据测定DAP和精胺(线)Michaelis-Menten方程（见“实验程序”）。K（K）米=1.01±0.18米米和k个猫=0.015±0.001秒−1DAP和K（K）米=1.05±0.32米米和k个猫=0.014±0.001秒−1用于精胺。
图3。
图3。
底物为DAP（IC）的BAPN对LOLX2的抑制作用50= 5. 0 ± 1.4 μ米)和精胺（IC50= 3.8 ± 0.2 μ米).最终反应包含25 n米LOXL2，15米米DAP或精胺。数据标准化为“无抑制剂对照”
图4。
图4。
LOXL2失活动力学。 A类当DAP用作不同浓度的底物时，失活率与BAPN浓度的依赖性的一个典型示例。给出了DAP的浓度。B类，二阶速率常数(k个不正确的/K（K）我)作为DAP浓度的函数。这个k个不正确的/K（K）我值是中数据的斜率A类绘制的数据是重复的平均值误差线表示标准偏差。C，表示灭活率与BAPN在不同精胺浓度下的函数关系的图。D类，依赖k个不正确的/K（K）我精胺浓度。所示为重复次数的平均值误差线s是标准偏差。
图5。
图5。
AB0023对赖氨酰氧化酶家族五个成员的结合特异性(A类)，使用表面等离子体共振的LOXL2(B类). 这个纵坐标描述了信号横坐标是以秒为单位的时间。图中显示了25 n浓度下AB0023与LOXL2结合的动力学轨迹米，12.5牛顿米，6.25牛顿米和3.125 n米25°C和LOXL2的不同SRCR结构域片段(C). 使用基于ELISA的分析和数据拟合（如“实验程序”所述）检测与赖氨酰氧化酶家族和SRCR片段的结合。在ProteOn XPR系统上进行表面等离子共振实验，并使用ProteOn-Manager软件分析数据。(D类)、AB0023与hLOXL2、hLOXL3和hLOXL完整SRCR结构域的结合评估(E类)hLOXL4使用基于ELISA的方法。
图6。
图6。
AB0023在DAP（IC）的反应中抑制LOXL250′=62±5.8牛顿米)和精胺（IC50′=55±11牛顿米)(A类)或I型胶原蛋白（IC50′=60.9±3.9牛顿米)(B类)用作基底。LOXL2浓度为25 n米当使用DAP和精胺时。对于胶原I反应，LOXL2在100n米.CAB0023对活性hLOXL3酶活性的影响是AB0023浓度的函数。最终反应混合物含有20 n米hLOXL3，15米米DAP和AB0023的指示浓度。D类BAPN对hLOXL3的抑制作用，其中底物为DAP。最终条件如C所述。观察到的IC50针对hLOXL3的BAPN为3.4μ米± 1.9 μ米。所有数据均归一化为不含AB0023或抑制剂的酶速率。
图7。
图7。
AB0023对DAP的抑制方式（α=1。02 ± 0.05, β = 0.53 ± 0.04) (A类)和精胺（α=1.13±0.26，β=0.51±0.06）(B类)在不同浓度的AB0023存在下（如图所示）。两种底物的反应与非竞争性抑制剂的反应一致（α=1，见正文）。
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