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.2010年8月；139（2）：609-19、619.e1-6。
doi:10.1053/j.gastro.2010.04.050。 Epub 2010年6月18日。

钙调神经磷酸酶1调节因子控制成人胰腺的生长可塑性

格热戈兹·T·古尔达 1, 斯蒂芬·克罗齐, 宝安记, 斯蒂芬·A·恩斯特, 克雷格·D·洛格斯顿, 贝弗利·A·罗瑟梅尔, 约翰·威廉姆斯
附属公司

钙调神经磷酸酶1调节因子控制成人胰腺的生长可塑性

格热戈兹·T·古尔达等。 胃肠病学. 2010年8月.

摘要

背景和目标：胰腺外分泌的生长受胃肠激素的调节，尤其是胆囊收缩素（CCK）。CCK驱动的胰腺生长需要钙调神经磷酸酶（CN），它激活活化T细胞核因子（NFAT），但调节这种反应的遗传基础和反馈机制尚不清楚。

方法：含有蛋白酶抑制剂（PI）的杂粮刺激胰腺生长，从而诱导内源性CCK的分泌。在Affymetrix 430A芯片上进行PI刺激的表达谱分析，并通过FK506抑制CN。通过用“flox-on”Rcan1小鼠培育弹性蛋白酶-Cre（雌激素受体[ER]）转基因，实现了CN抑制剂钙调磷酸酶1调节器（Rcan1）在胰腺外分泌特异性过度表达。

结果：定量聚合酶链反应证实，CN抑制剂FK506阻断了38个基因的表达。CN依赖基因与生长相关过程相关，而其启动子在NFAT和NFAT/AP1位点富集。染色质免疫沉淀法验证了多个NFAT靶点，包括Rcan1、Rgs2、HB-EGF、Lif和Gem。其中一种是CN反馈抑制剂Rcan1，在胰腺生长1-8小时的过程中诱导大于50倍，FK506强烈抑制（>99%）。为了研究其在胰腺生长中的作用，我们以可诱导、腺泡特异的方式过度表达Rcan1。Rcan1过度表达抑制了CN-NFAT信号传导，如NFAT核糖核酸酶报告子和定量聚合酶链反应所示。最重要的是，在Rcan1过度表达小鼠中，外分泌胰腺大小、蛋白质/DNA含量和腺泡增殖的增加均被阻断。

结论：我们对适应性胰腺生长进行了描述，确定Rcan1是一种重要的新反馈调节因子，并确定CN-NFAT信号传导是这种反应所必需的。

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数字

图1
图1。胰腺生长中PI诱导和CN依赖基因的特征
(一)上图：微阵列实验的实验设计。箭头显示了生物学意义上的比较：PI-feeding改变了基因（红色），FK506抑制了基因（蓝色）。底部：PI喂养显著增加了81个基因的表达（>3倍，q≤0.08），而FK506显著（>70%，q≤0.05）阻断了38个基因。(B类)从四组（n=3-8/组）小鼠的胰腺中获取RNA样本：(1)对照组小鼠隔夜禁食，(2)小鼠隔夜禁食，再喂PI-chow 2小时(3)与之前相同，除了用3mg/kg FK506和（4）CCK缺陷小鼠每天预处理两次外，隔夜禁食并参考PI。条形图表示qPCR相对于空腹对照的平均±SEM表达#与2h PI（黑色条）相比，p<0.05和#<0.01。(C类)38个CN依赖基因和81个PI诱导基因的分子概念网络关联，表示为两个浅绿色节点。网络中的每个节点代表一个分子概念或一组生物相关基因，在图例中用颜色编码。节点的大小与基因的数量成正比，连接表明在统计学上显著增加（p<0.005）。与增长/分化相关概念的链接以蓝色显示。
图2
图2。描述NFAT调节基因
(一)近端启动子（MatInspector™)获得并对齐了38个CN依赖基因的小鼠、大鼠和人类直系同源基因的调控区（rVISTA）。注意，MatInspector™没有自动检索RCAN1第4外显子转录的近端启动子。通过人工检索，RCAN1是一个高置信度的鉴定。(B）MatInspector分析了21个实验建立的启动子、NFAT调节基因（金标准）和一组21个随机基因™采用与（A）相同的方法和标准进行评估。（C）A23187刺激NFATc1与五个CN依赖基因启动子结合的染色质免疫沉淀（ChIP）分析，计算预测NFAT将调节这五个基因的启动子。对266-6个细胞进行了研究。Pol II结合被用作转录活性基因的读出，EF1α的引物集被用作对照。（D）在原代分离的小鼠腺泡细胞中进行CCK刺激NFATc1与（C）中相同的五个CN依赖基因启动子结合的ChIP分析。
图3
图3。含PI的食物增加RCAN1表达
将小鼠禁食过夜，重新喂食含有PI的食物1-8小时，然后处死。(一)随着喂食PI，RCAN1的mRNA表达显著增加（**p≤0.01，n=5-6），但RCAN2或RCAN3的mRNA没有显著增加。18S RNA作为对照。(B类)PI-喂食可显著诱导RCAN1的外显子4形式（*p<0.05或*p<0.01），在2h达到峰值。26kDa形式RCAN1和亲环素a（CycloA）负荷控制的代表性western blot显示在条形图上，该条形图量化了每个时间点5-6只小鼠的3个独立实验的结果。(C类)CCK在NIH3T3 CCK-AR细胞中以CN依赖方式激活Rcan1-荧光素酶报告子，呈剂量依赖性。（*p≤0.05，n=5-6）(D类)野生型小鼠胰腺24kDa RCAN1型和亲环素A（负荷控制）的代表性western blot，禁食、自由进食、隔夜禁食，并参考标准或含PI的饮食；CCK缺乏小鼠禁食和参考含有PI的饮食。
图4
图4。RCAN1过度表达在功能上抑制CN-NFAT通路
(一)CCK在与RCAN1或β-gal/GFP腺病毒孵育的孤立腺泡中对NFAT-核糖核酸酶报告子的剂量反应激活（n=3，*p<0.05与时间零点；#p<0.05与对照病毒）。(B类)注射TAM的Ela-Core（ER）/Rcan1或野生型同窝雄鼠新鲜分离的腺泡中NFAT-luciferase报告子的剂量反应激活（n=3，*p<0.05与时间零点；#p<0.05与对照组）（C）用禁食对照组和Ela-Core（ER）/RCAN1或禁食并喂食含PI2小时的野生型窝鼠的RNA样本进行RT-qPCR。所有小鼠均注射TAM。所示为一组八个基因相对于空腹对照的平均±SEM诱导（n=4-7；#p<0.05 vs.2h PI野生型）。
图5
图5。RCAN1转基因阻断腺泡细胞增殖体内.（A）
注射TAM的野生型小鼠和Ela-Core（ER）/RCAN1小鼠禁食并参考标准或含PI的食物2天，用BrdU处理，2小时后处死。BrdU免疫染色的代表性载玻片为红色，DAPI为蓝色，覆盖为粉红色（白色箭头）。在3-5只小鼠上进行的实验结果被量化为总DAPI染色中BrdU染色的%细胞**与标准食物相比p<0.01#与野生型喂食含PI的食物相比，p<0.05。（B）BrdU（粉红色细胞核/白色箭头）并入形态成熟、表达淀粉酶（绿色）的腺泡细胞。
图6
图6。RCAN1的Acinar特异性过表达阻断胰腺生长
（A）注射TAM的野生型和Ela-Core（ER）/RCAN1小鼠喂食标准或含PI的食物10天。年龄和体重（BW）匹配小鼠胰腺的代表性照片。正方形为6×6mm。（B）野生型和Ela-Core（ER）/RCAN1小鼠的相对胰腺重量，喂食标准或含PI的食物0–10天。所有动物均预先注射TAM；n=3-5，**p<0.01与第0天相比##与同一天野生型喂食含PI的食物相比，p<0.01。（C、D、E）第7天胰腺相对重量（C）、蛋白质（D）和DNA含量（E）的变化；注射TAM的野生型、Ela-Core（ER）/RCAN1和单转基因窝鼠（n=4-6）喂食标准或含PI的母猪（**p<0.01 vs野生型；##p<0.01 vs.野生型PI）。
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