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.2010年5月；13（5）:584-91。
doi:10.1038/nn.2535。 Epub 2010年4月25日。

选择性诱导星形胶质细胞增生导致神经元抑制缺陷

帕维尔I奥廷斯基 1, 董京辉, 艾莉森·蒙根纳斯特, 崔永岳, Hajime Takano公司, 黛博拉·J·沃森, 菲利普·海登, 道格拉斯·A·库尔特
附属公司

选择性诱导星形胶质细胞增生导致神经元抑制缺陷

帕维尔I奥廷斯基等。 自然神经科学. 2010年5月.

摘要

反应性星形细胞增多症在许多神经系统疾病中发生，包括癫痫。星形细胞对病理生理学的贡献尚不清楚。检查这一点的研究被反应性星形细胞增多症的合并症所混淆。我们发现，通过腺相关病毒高滴度转导带有增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的星形胶质细胞可诱导反应性星形胶质细胞增多，而不会改变邻近神经元的固有特性或解剖结构。我们研究了选择性星形细胞增生诱导对小鼠CA1锥体神经元突触传递的影响。eGFP标记的反应性星形胶质细胞附近的神经元减少了抑制性而非兴奋性突触电流。这种抑制性突触后电流（IPSC）侵蚀是由于星形细胞谷氨酸-谷氨酰胺循环的失败所致。反应性星形胶质细胞下调谷氨酰胺合成酶的表达。阻断这种酶通常会导致突触GABA快速耗竭。在星形胶质细胞区域，残留抑制对谷氨酰胺合成酶阻断失去敏感性，而外源性谷氨酰胺给药增强了IPSC。星形胶质细胞介导的抑制缺陷触发了海马回路中谷氨酰胺可逆性超兴奋性。因此，反应性星形细胞增多症可能导致局部突触紊乱，导致与神经疾病相关的更广泛的功能缺陷。

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数字

图1
图1。星形细胞特异性eGFP表达
(a–d)共焦图像描绘(一)病毒注射诱导eGFP表达（绿色）(b条)NeuN免疫染色（蓝色），以及(c（c）)海马中的GFAP（红色）。(d日)eGFP与GFAP（星形胶质细胞标记物；箭头）共定位，但与NeuN（神经元标记物）不共定位。(e–g)高倍图像显示eGFP荧光与GFAP染色联合标记。(小时)AAV2/5-gfa104-eGFP质粒示意图（详见方法）。
图2
图2。AAV2/5-gfa104-eGFP诱导星形胶质细胞的效价依赖性反应
(a–d)注射低病毒滴度（1×109GC/注射），eGFP+细胞表现出正常的星形细胞形态，GFAP和波形蛋白染色水平较低。(e–h)相反，eGFP+高滴度注射标记细胞（3×1010GC/注射）显示出典型的反应性星形胶质细胞的肥大形态(e（电子）)以及强烈的GFAP和波形蛋白染色(f、 克). (i–l)注射低滴度eGFP后+/GFAP公司+细胞表现出正常的星形细胞形态，并且对谷氨酰胺合成酶（一种星形细胞特异性酶）呈免疫反应。(米——对)高滴度注射导致eGFP中谷氨酰胺合成酶免疫反应性丧失+/GFAP公司+细胞。合并的图像如所示d、 小时，小时和对. (q–s)辐射层GFAP、波形蛋白和谷氨酰胺合成酶免疫染色的滴度依赖性。表达水平被量化为免疫反应超过背景阈值强度的区域和免疫反应的平均强度。**，p<0.01；***，p<0.001，相对于野生型动物。#，p<0.01；###，p<0.001，相对于盐水注射动物。误差线，s.e.m。
图3
图3。靠近反应性星形胶质细胞的CA1锥体细胞中抑制性神经传递受损
(一)来自远端控制细胞和锥体细胞（eGFP）的eIPCS样本痕迹−)和近端（eGFP+)AAV2/5转导的星形胶质细胞。与反应性星形胶质细胞相邻的神经元中的eIPCS要小得多(b条)对照组和AAV2/5注射动物CA1神经元eIPSC振幅分布直方图。eGFP中的IPSC分布+与对照组相比，神经元向更小的值倾斜。(c（c）)4个AAV2/5和6个对照细胞的mIPSC振幅的累积频率分布。注意，与对照组相比，AAV2/5细胞中的振幅分布向左偏移，小振幅mIPSC最大偏移（分布显著不同，p=0.001，K-S检验）。(d日)AAV2/5和对照细胞中的mIPSC振幅按四分位数分组，归一化为对照组的mIPCC平均值，并进行比较。AAV2/5神经元中mIPSC减少的程度随着人群分布四分位数的增加而逐渐减少（**，p<0.001，K-S检验，误差条，S.e.m.）。(e（电子）)对照组和AAV2/5细胞在训练刺激之前、期间和之后诱发反应的平均时间序列（每20秒以50 Hz频率4次脉冲，持续15分钟），标准化为第一次诱发事件的振幅。火车刺激会引起注射AAV2/5的细胞中eIPCS的长期抑制（至少持续记录8分钟以上），而非对照动物。误差线，s.e.m(（f）)一个典型的CA1锥体细胞，充满由eGFP（绿色）/GFAP（红色）阳性星形胶质细胞包围的生物细胞素（蓝色）。
图4
图4。反应性星形胶质细胞近端CA1锥体神经元中保留的兴奋性神经递质
(一)在缺少谷氨酸和GABA的情况下，对照组和AAV2/5切片中CA1锥体细胞的痕迹一个受体拮抗剂（V持有=−40毫伏）。在每个跟踪中，一个eIPSC跟在一个eEPSC后面。请注意，EPSC的振幅相似，而IPSC减小。(b、 c（c）)eEPSC和eIPSC振幅和电荷转移直方图。eEPSC振幅和电荷转移相似（eEPSC幅度：控制n=10，AAV2/5 n=15，p=0.34；eEPSC电荷：控制n=9，AAV2/5 n=12，p=0.59），而eIPSC振幅和荷电转移在AAV2/5电池中都较小（eIPSC幅度：控制n=6，AAV2/5 n=12，*，p=0.014；eIPSC电荷：控制n=6，AAV1/5 n=12，*，p=0.006）。AAV2/5 eIPSC平均值不包括在用于引发兴奋性反应的刺激强度下未能显示eIPSC的两个细胞。(d、 e（电子）)eEPSC从RRP（20 Hz，2 s）和储备池（10 Hz，90 s）刺激中恢复的时间进程。在RRP和储备池刺激之前，在10-15个单脉冲（0.07 Hz）期间，振幅归一化为平均（基线）eEPSC。(（f）)平均eEPSC振幅的直方图。在RRP刺激后5分钟和储备池刺激后12分钟内以0.07 Hz的频率诱发eEPSC（对照组RRP n=9，储备池n=8，AAV2/5 RRP n=8，储备池n=7）。无论是对照组（p=0.1）还是AAV2/5组（p<0.35），在没有和存在苦毒毒素的情况下，基础eEPSC电流振幅没有差异。误差线，s.e.m。
图5
图5。谷氨酸-谷氨酰胺循环缺陷降低囊泡GABA浓度
(一)左侧，MSO处理细胞与未暴露于MSO的细胞在列车刺激期间和之后的eIPCS比较。赖特，在MSO（1.5 mM）中孵育后，列车刺激对eIPSC振幅的影响表示为与无MSO时记录的eIPCS相比的%变化（参见图3e）。MSO会触发对照组eIPSC振幅的活性依赖性降低，但不会触发AAV2/5细胞（**，与对照组相比p<0.001）。(b条)左侧，mIPSC在TPMPA和SR95531不存在（薄记录道）和存在（厚记录道）时的平均值。赖特，TPMPA显著降低AAV2/5 eGFP神经元的mIPSC振幅+细胞（AAV2/5（+/-TPMPA）：9.5±1.2 pA/7.1±0.9 pA，n=6，p=0.005，配对t检验；对照组（+/-TPMPA）：12.5±1.6 pA/12.2±2 pA，n=6，p=0.87，配对t检验）。SR95531将两组细胞的mIPSC振幅降低到相似的程度（AAV2/5（+/-SR9553l）：12.3±1.4 pA/9.9±1.4 pA，n=5，p=0.033，配对t检验；对照组（+/-SR95531）：13.6±2.1 pA/11.1±1.8 pA，p=0.004，配对t检验）。*，p＝0.027。(c（c）)左侧，施用10 mM谷氨酰胺之前（薄迹线）和期间（厚迹线）的电流迹线。中部，补充谷氨酰胺可部分逆转AAV2/5细胞亚群中eIPSC的失败（**，相对于对照组p<0.001；AAV2/5n=5，对照组n=7）。赖特，浴用谷氨酰胺在列车刺激后将eIPSC振幅恢复到控制水平，但未能防止列车期间eIPSC故障（**，p≤0.003，相对于控制，^，p=0.04，相对于AAV2/5）。单元编号（列/列后）如下：控制n=12/10，AAV2/5 n=10/6，AAV2/5+Gln n=6/5。误差线，s.e.m。
图6
图6。反应性胶质细胞增生与网络过度兴奋有关
(一)海马准备示意图。阴影框表示（b）中用于快照的区域。DG，齿状回；EC，内嗅皮层；刺激电极。(b条)在TAP刺激开始之后的指示时间点处的VSD信号快照。白色虚线表示（c）SLM中光栅图的采样像素，分子腔隙层、SR、，放射层、SO、，地层oriens. (c（c）)顶行，荧光信号的振幅和时间进程以及CA细胞层海马活动的光栅图。注意对照组中EPSP与远端SR的分隔，而不是AAV2/5切片。最下面一行，来自CA1锥体神经元的电流闪烁轨迹。TAP刺激从AAV2/5 eGFP诱导细胞内EPSP+区域和来自对照动物细胞的IPSP。(d、 e（电子）)TAP刺激激活的荧光信号振幅和面积（**p<0.008，*p=0.016；对照n=6，AAV2/5 n=10）。控制片中的SO IPSP从eGFP转换为片中的SO EPSP+AAV2/5片。(（f）)之前TAP激活引发的荧光变化(左侧)和以下内容(赖特)谷氨酰胺在浴缸中15分钟用于eGFP+AAV2/5切片。(g、 小时)AAV2/5 eGFP中谷氨酰胺应用前后的正常荧光变化和活化面积+切片（*，p=0.04，配对t检验，n=5）。在SO中，AAV2/5组的活动区较小，但与对照组相比未达到显著性（p=0.09，配对t检验）。误差线，s.e.m。
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