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.2010年5月15日；24(10):992-1009.
doi:10.1101/gad.1884710。 Epub 2010年4月22日。

哺乳动物microRNAs：新基因和先前注释基因的实验评估

H罗萨里亚·蒋 1, 洛里·肖恩菲尔德, J格雷厄姆·鲁比, 文森特·奥扬, 诺亚间谍, 大云白, 温迪·约翰斯顿, 卡斯滕·罗斯, 罗淑君, 约书亚·E·巴比亚兹, 罗伯特·布利洛赫, 加里·普·施罗斯, 乍得·纳斯博姆, 大卫·P·巴特尔
附属公司

哺乳动物microRNAs：新基因和先前注释基因的实验评估

H罗萨里亚·蒋等。 基因开发. .

摘要

微RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一种小的调节性RNA，来源于独特的发夹转录物。为了进一步了解哺乳动物的miRNAs，我们从小鼠大脑、卵巢、睾丸、胚胎干细胞、三个胚胎阶段和整个新生儿中测序了6000万个小RNA。对这些序列的分析证实了398个注释的miRNA基因，并鉴定了108个新的miRNA基因。150多个先前注释的miRNAs和数百个候选基因未能产生具有miRNAs-like特征的测序RNA。在外表达这些先前提出的miRNA发夹也不会产生小RNA，而在外表达已确认和新发现的发夹通常会产生具有经典miRNA特征的小RNA，包括依赖Drosha内切酶进行处理。这些实验表明，之前对保守哺乳动物miRNAs的估计被夸大了，提供了一份经过实质性修订的可靠鉴定的小鼠miRNA清单，从中可以推断出哺乳动物miRNA的一般特征。我们的分析还揭示了miRNA生物发生和修饰的新方面，包括组织特异性链偏好、后生动物前体miRNA（pre-miRNA）的顺序Dicer切割、相应的5'异质性、新发现的miRNA编辑实例、，以及广泛存在的前miRNA尿苷化的证据，这让人想起Lin28对miRNA的调节。

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数字

图1。
图1。
小鼠miRNAs和候选基因最初通过高通量测序鉴定。(A类)先前注释的miRNA发夹（miRBase版本14.0；绿色）、当前研究中确定的miRNA候选，以及符合我们分类标准的这些候选子集之间的重叠，即自信确定的典型miRNA（红色）。其他考虑因素增加了自信确定的典型miRNAs数量至475个。(B类)先前注释的mirtrons和shRNAs与我们研究支持的mirtronis和shRNA之间的重叠，颜色如A类.
图2。
图2。
注释的miRNAs和先前提出的候选基因的实验评估。(A类)转染HEK293T细胞的表达载体示意图。(B类)标准异位表达试验的例子，转染质粒显示在关键。对照转染（无发夹质粒）的读数来自HEK293T细胞的内源性表达。(C类)注释人类miRNAs和已发表候选基因的分析结果。条形图的颜色如所示B类; 星号表示可检测的过度表达（从预期的miRNA和miRNA*中读取≥1，miRNA和miRNA*的联合表达是内源性水平的三倍以上）。(D类)未经证实的注释小鼠miRNAs和已发表候选基因的检测结果。小鼠对照组是从我们的小鼠样品中测序的miRNAs中选择的。条形图的颜色如所示B类; 显示可检测到的过度表达（星号）。显示了两个实验的结果（补充图S3、S4）。
图3。
图3。
新型miRNAs和候选基因的实验评估。(A类)评估Drosha依赖性、转染质粒的试验示例如图例所示。(B类)对照miRNA、新miRNA和miRNA候选物的分析结果。条形图的颜色如所示A类; 可检测到的过度表达（黑色星号）、试图但未检测到的过表达（黑色减号）、可检测到Drosha依赖性（橙色星号）和检测到但未检测出的Drosha依存性（橙色减号）都显示出来。显示了三个实验的结果（补充图S5-S7）。
图4。
图4。
miRNA相对表达谱。如前所述构建成熟miRNAs的图谱（Ruby等人，2007b）。提供了每个样本中每个miRNA的相对贡献以及所有样本的归一化读数总和（补充表5）。
图5。
图5。
从发夹的两臂读取，从同一臂依次读取。(A类)从每个miRNA发夹中读取miRNA的分数和丰度。为了计算分数，将miRNA读数除以miRNA和miRNA*读数的总数，考虑到每只手臂上只有主要的5′末端。虚线表示保守（红色）和非保守（蓝色）miRNA的miRNA读取中位数和miRNA读取的中位数。(B类)不同样本中主导臂的切换。对于每个样品，计算了5′臂产生的miRNA读数与3′臂产生miRNA读数的倍数，反之亦然。图中显示的是切换优势臂的非重复性miRNAs的结果，两个样本之间的差异至少为五倍。样本是彩色编码的（关键），星号表示样本中一个臂产生的miRNAs在统计上显著富集(P（P）< 0.05, χ2测试）。(C类)顺序Dicer分裂。预测的二级结构mmu-mir-3102型miRNA前体（Hofacker等人，1994年）。
图6。
图6。
具有5′异质性的miRNAs。(A类)保守（红色）和非保守（蓝色）miRNAs的分布，其5′末端的读值≤5nt偏移。(B类)每个miRNA发夹的偏移读取分数和读取丰度，颜色如A类虚线表示保守（红色）和非保守（蓝色）miRNA的读取中位数。(C类)miR-133a的5′非均一性。来自小鼠心脏（Rao等人，2009年）和新生儿的数据映射到mir-133a-1发夹(顶部)，异位表达分析的数据映射到所示的转染发夹(底部). 这些线表示miR-133a.1（深蓝色）和miR-133a.2（浅蓝色），而红色核苷酸表示那些在mir-133a-1和mir-133a-2. (D类)丢失miR-223对miR-222主要和次要亚型的3′UTR位点信息的影响。(顶部)小鼠中性粒细胞的小RNA测序数据（Baek等人，2008）被映射到密尔-223发夹，如C类对于miR-233（主要亚型位点，左下角; 次要亚型位点，右下角)根据体内分化中性粒细胞的已发表数据，绘制了miR-223缺失后变化程度至少为所示的分数（Baek等人，2008年）。(电子)丢失miR-155对miR-155-主要和次要亚型的3′UTR位点信息的影响，如图所示D类使用T细胞公布的数据（Rodriguez等人，2007年）。(顶部)我们研究的测序数据被映射到mir-155型发夹，如C类小亚型具有8mer和7mer-A1位点的mRNA被排除在分析之外，因为这些位点与主要亚型的7mer-m8位点重叠。
图7。
图7。
未模板核苷酸添加。(A类)从指示臂读取miRNA和miRNA*的未模板核苷酸添加率。提供了每种miRNA的比率（补充表6）。作为对照，对tRNA降解片段进行了类似分析。括号中显示了所分析的基因数量。(B类)5′臂（蓝色）和3′臂（红色）RNAs非模板化U加成的速率分布。(C类)5′臂（蓝色）和3′臂（红色）RNAs的非模板A加成率分布。(D类)生物发生阶段的示意图，其中U可以被添加到仅一个臂的RNA中（pre-miRNA，左边)以及U可以添加到任一臂的RNA中的阶段（成熟miRNA和miRNA*，正确的).
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