跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

政府意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2010年4月27日；107(17):7811-6.
doi:10.1073/pnas.1000063107。 Epub 2010年4月7日。

Trs85将Ypt1 GEF（TRAPPIII）导向吞噬细胞以促进自噬

莫莉·林奇日 1, 迪帕利·班达里, 谢卡·梅农, 朱黄（Ju Huang）, 蔡华清, 克林顿·R·巴塞洛缪, 约翰·布鲁梅尔, 苏珊·费罗·诺维克, 丹尼尔·克林斯基
附属公司

Trs85将Ypt1 GEF（TRAPPIII）导向吞噬细胞以促进自噬

莫莉·林奇日等。 美国国家科学院程序. .

摘要

巨自噬（以下简称自噬）是真核细胞中普遍存在的一种过程，它与细胞和生物体生理学的各个方面都有密切关系。自噬的形态学特征是形成双膜细胞溶质小泡，即自噬体，它隔离细胞质货物并将其传递到溶酶体或液泡。因此，自噬涉及动态膜动员，但形成自噬体的脂质来源和膜传递机制尚不明确。TRAPP复合物是激活Rab GTPase Ypt1的多聚鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF），该酶是分泌所必需的。在这里，我们描述了这种复合物的另一种形式（TRAPPIII），它作为Ypt1的自噬特异性GEF。TRAPPIII复合物的Trs85亚单位将Ypt1 GEF导向参与自噬体形成的吞噬细胞组装位点（PAS）。与Ypt1 GEF直接作用于PAS的观察结果一致，我们发现Ypt1对自噬至关重要。这是Rab GEF的一个例子，它专门针对典型的自噬体形成。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
Trs85不与Trs130、Trs120和Trs65共沉淀。(一个)Trs85在Superdex-200柱分数8-10中发现。分离纯化的裂解产物（来自菌株SFNY1295和SFNY1302），并用抗myc抗体进行Western blot分析(顶部和中部)或抗Trs33抗体(底部). (B类)Trs130、Trs120和Trs65不会与裂解物中的Trs85共沉淀。用抗myc抗体对清除的裂解产物进行免疫沉淀，并对所示TRAPP亚单位进行免疫印迹。顶部用抗myc抗体印迹下部具有亚单位特异性抗体。星号表示Trs120的降解产物。
图2。
图2。
识别激活Ypt1的第三个TRAPP复合物。(一个)Trs85-myc与Trs33、Trs31、Trs23、Bet3、Trs20和Bet5共沉淀。对放射性标记的裂解物（分别来自菌株SFNY1295和NY915）进行分馏，并按照材料和方法. (B类)确认与Trs85共沉淀的TRAPP亚单位。在Superdex-200柱上对从SFNY1295菌株制备的裂解液进行分馏。用抗myc抗体免疫沉淀组分8，并用所示TRAPP亚单位的抗体进行Western blot分析。(C类)Trs130、Trs120和Trs65不与来自馏分8的Trs85共沉淀。对放射性标记的裂解物（来自菌株SFNY1301和SFNY1295）进行分离，并对部分8进行免疫沉淀。Trs65上方出现的两个暗带是污染物（请参阅中未标记的控件一个车道2）。星号表示Trs120的降解产物。(D类)Trs85不是TRAPPI复合物的成分。对放射性标记的裂解物（来自菌株SFNY1295、SFNY656和NY915）进行分级，并对级分12进行免疫沉淀。(E类)TRAPPIII是Ypt1全球环境基金。TRAPPII从含有TAP标记的Trs65的菌株（SFNY1075）中纯化，TRAPPIII通过将裂解物与IgG Sepharose珠孵育而从表达TAP标记的Trs85的菌株（SFNY1080）中纯化，如前所述（8）。然后使用这些小球检测GTPγS对Ypt1的摄取。将显示的数据归一化为IgG-Sepharose微球上Trs33的含量。
图3。
图3。
Ypt1参与酵母的非特异性自噬。(一个)同基因野生型（WT）和指示的密码1突变菌株在允许温度（30℃或25℃）的生长培养基（SMD）中培养至指数期，然后转移至非允许温度（14℃或37℃）；这个埃及1-1突变体对生长具有低温敏感性，并在14°C下进行了分析。同时，在每个温度下将细胞切换到氮气饥饿（SD-N）培养基中4小时。收集每个条件下的细胞裂解液，并对Pho8Δ60活性进行分析。误差条指示SE(B类)等基因野生型和密码1突变菌株用GFP-Atg8转化，生长到指数阶段，如一个然后转移到非允许温度下30分钟。添加雷帕霉素（0.2μM）4小时。显示GFP-Atg8和液泡限制膜的外荧光图像（用FM 4–64染色）。（比例尺，2.5μm）
图4。
图4。
这个密码1突变体对Cvt途径有缺陷。等基因野生型和密码1图3中使用的突变菌株和atg1处Δ对照菌株在富培养基（SMD）中以指示的允许温度培养至指数期，然后移至指示的非允许温度培养60分钟。蛋白质提取物通过SDS/PAGE进行解析，并用抗Ape1抗血清进行Western blot分析。prApe1和成熟Ape1的位置如图所示。
图5。
图5。
Ypt1过度表达增强了自噬，组成活性Ypt1绕过了对其GEF的要求。(一个)野生型（WT；TN124），atg1处Δ和Ypt1过表达（OE Ypt1）的细胞在30°C下生长，并转移到SD-N培养基中4小时。通过Pho8Δ60分析蛋白质提取物。误差条表示SE。星号表示与WT级别的显著差异，对< 0.05. (B类)重量，atg1处Δ，以及密码1Q67L型细胞生长和分析一个. (C类)重量，atg1处Δ和trs85型含有空载体或编码Ypt1或Ypt1的质粒的Δ细胞Q67L型在富培养基至指数生长阶段生长。蛋白质提取物通过SDS/PAGE进行解析，并用抗Ape1抗血清进行Western blot分析。
图6。
图6。
Ypt1和Trs85本地化为PAS。(一个)野生型（WT，SEY6210），atg1处Δ（WHY1），第9天Δ（JKY007），以及trs85型表达RFP-Ape1和GFP-Ypt1的质粒转化Δ（YJH3）细胞；(B类)WT（YJH9），atg1处Δ（YCB151），以及第9天表达整合RFP-Ape1和Trs85-3xGFP的Δ（MDY15）细胞；(C类)WT（SFNY1573）和第9天Δ表达Trs65-3xGFP的菌株（MDY12）；或(D类)的第9天表达Trs130-3xGFP（MDY10）的Δ菌株在SMD培养基中培养至指数期，然后转移至SD-N培养基中45分钟。然后通过荧光显微镜分析细胞。箭头标记重叠的GFP-Ypt1和RFP-Ape1点，以及重叠的Trs85-3xGFP和RFP-Ape1点。（比例尺，2.5μm）
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

参考文献

    1. 黄J，Klinsky DJ。自噬与人类疾病。细胞周期。2007;6:1837–1849.-公共医学
    1. 水岛N、莱文B、克尔沃AM、克林斯基DJ。自噬通过细胞自我控制与疾病作斗争。自然。2008;451:1069–1075.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 雷焦里F.1。自噬的膜起源。当前最高开发生物。2006;74:1–30.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Hamasaki M，Noda T，Ohsumi Y。早期分泌途径有助于酵母的自噬。细胞结构功能。2003;28:49–54.-公共医学
    1. Reggiori F等人。酿酒酵母的Cvt囊泡和自噬体组装需要分泌途径的早期阶段，而不是内体。分子生物学细胞。2004;15:2189–2204.-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型