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.2010年4月2日；141(1):81-93.
doi:10.1016/j.cell.2010.01.031。

持续的端粒损伤导致有丝分裂旁路和四倍体

特蕾莎·达沃利 1, 厄洛斯·拉泽里尼·登基, 蒂蒂亚·德兰格
附属公司

持续的端粒损伤导致有丝分裂旁路和四倍体

特蕾莎·达沃利等。 单元格. .

摘要

四倍体化被认为是人类癌症非整倍体形成的中间步骤，但缺乏在肿瘤发生过程中诱导四倍体形成的一般机制。我们报告称，p53缺陷细胞中发生四倍体化，由于端粒持续功能障碍，DNA损伤信号延长。活细胞成像显示，由于ATM/ATR和Chk1/Chk2介导的Cdk1/CyclinB抑制，这些细胞的G2延长，最终绕过有丝分裂。尽管缺乏有丝分裂，但细胞表现出APC/Cdh1依赖性的复制抑制剂双生素降解，随后Cdt1积累，这是来源许可所必需的。然后细胞进入第二个S期，导致全基因组重复和四倍体。端粒保护恢复后，这些四倍体细胞恢复细胞分裂周期并增殖。这些观察结果表明，当端粒过度缩短导致端粒功能障碍时，在肿瘤发生的早期诱导四倍体形成的一般机制。

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数字

图1
图1。持续DNA损伤信号诱导的多倍体
（A） POT1a/b缺失或连续玉米霉素处理后的多倍体化。POT1a公司前/后POT1b型前/后MEF用Cre、载体对照、zeocin处理或不处理，并在指定的时间点用FACS分析。给出DNA含量>4N的细胞百分比。显示了具有代表性的FACS分析。（B） POT1a/B DKO细胞和zeocin处理的细胞中有53BP1病灶。POT1a公司前/后POT1b型前/后MEF用Cre、zeocin治疗，或如（A）中所述不治疗，然后处理IF，以获得53BP1（红色）（DNA用DAPI染色（蓝色））。给出了平均53BP1病灶/细胞核和SEM（n>50）。（C） POT1a/b缺失或连续博来霉素诱导的多倍体的定量。POT1a公司前/后POT1b型前/后MEF按（A）进行处理和分析。条形图显示了3个独立实验的平均值和SD。（D，E F）抑制ATM和ATR后多倍体减少。POT1a公司F/−POT1b型前/后自动取款机−/−和POT1a前/后POT1b型前/后自动取款机+/−用ATR shRNA或载体控制治疗。多倍体测定如（A）所示。显示了一个代表性实验（D）的FACS曲线和3个独立的SDs实验（F）中多倍体细胞百分比的量化。免疫印迹显示所示细胞中的ATR敲除和Chk1和Chk2磷酸化如（E）所示。另请参见相关图S1C–E。（G，H，I）Chk1和Chk2受损后多倍体减少。POT1a公司前/后POT1b型前/后用Chk1和Chk2 shRNAs（第1组）或载体控制治疗MEF。多倍体测定如（D）所示。显示了一个代表性实验（G）的FACS曲线和3个独立实验（SD（I））中多倍体细胞百分比的量化。免疫印迹显示Chk1和Chk2敲除在（H）中。另请参见相关图S1F，G。
图2
图2。Cdk1/CyclinB和APC/Cdc20活性受损
（A） POT1a/b DKO细胞中有丝分裂APC靶点的异常稳定。POT1a公司前/后POT1b型前/后用Cre处理MEFs，2天后在G1/S中同步。通过免疫印迹分析所指示的蛋白质，并在印迹下方指示相应时间点的细胞数。（B） 用于（A）的细胞的S期进展。双胸腺嘧啶核苷（G1/S）释放后0和4小时BrdU阳性细胞的FACS分析。（C，E）POT1a/b DKO细胞中Cdk1/CycinB活性降低。POT1a公司前/后POT1b型前/后MEF按（A）处理，通过组蛋白H1-激酶分析测定Cdk1/CyclinB（C）和Cdk2/CyclinE（E）复合物的活性。磷脂酶-H1、组蛋白H1的考马斯染色、免疫印迹显示IP中的Cdk1（C）和Cdk2（E）以及激酶活性的定量显示。另请参见相关图S2A。（D，F）POT1a/b DKO细胞中Cdk1/CyclinB和APC/Cdc20激活的受损依赖于Chk1和/或Chk2。POT1a型前/后POT1b型前/后用Cre和两组Chk1和Chk2 shRNAs治疗MEF。所示蛋白质的免疫印迹如（D）所示。在用SD进行的两个独立实验中，Chk1和Chk2（组1）被击倒后，Cdk1/CyclinB激酶活性的定量（如（C）所示）如（F）所示。另请参见相关图S2B。
图3
图3。POT1a/b DKO和zeocin处理细胞有丝分裂的旁路
（A） POT1a的时间推移成像前/后POT1b型前/后用Cre处理的MEF、用zeocin处理的细胞和未处理的对照。72小时后，每隔15分钟拍摄一次相差显微镜图像，持续48小时（电影S1）。显示选定的时间点静止。相同颜色的箭头在成像过程中高亮显示同一个单元格。在POT1a/b DKO和zeocin处理的细胞中，箭头突出显示了未经历有丝分裂的代表性细胞。另请参见相关图S3。（B） 未进行有丝分裂的细胞数量和每个细胞的平均有丝分裂数。如（A）所示，对细胞进行处理和成像，并对电影进行分析。还显示了48小时内细胞周期蛋白E两次升高而没有进行有丝分裂干预的细胞百分比。对表达CyclinE-eGFP的细胞进行分析，如（A）所示（电影S2中的代表性电影）。针对每种情况，对每部电影中至少100个细胞进行分析。平均值和标准偏差是从3个独立实验中获得的。（C） POT1a/b DKO和zeocin处理细胞的核面积增加。如（A）中那样对细胞进行处理和成像。对于每种情况，在成像开始（0 h）和结束（48 h）时测量100个细胞的核面积，并显示为频率分布。P值基于非参数Krustal-Wallis检验。这些结果代表了三个独立的实验。
图4
图4。在POT1a/b DKO和zeocin处理的细胞中，Geminin和Cdt1交替出现
（A） 双生素和Cdt1的FUCCI成像。POT1a的延时成像前/后POT1b型前/后用FUCCI慢病毒载体转导MEF，表达mKO2-hCdt1（红色）和mAG-hGeminin（绿色）。用Cre或载体控制处理细胞，72小时后成像。每隔15分钟使用GFP和罗丹明滤光片拍摄相位对比图像和荧光图像（电影S3）。显示选定的时间点。方向相同的箭头在不同的时间高亮显示同一单元格。在对照细胞中，箭头突出显示了一个细胞在正常细胞周期（红-绿，有丝分裂）中的进展及其子细胞，直到它们移出视野。在Cre-treated细胞中，箭头突出显示了两个具有代表性的细胞，它们的颜色序列为红-绿-黄-绿，没有出现丝裂炎。（B） 内复制细胞中交替双生素和Cdt1表达的持续时间。POT1a公司前/后POT1b型前/后用载体控制、Cre（POT1a/b DKO）或zeocin（Movie S3）处理的MEF成像如（A）所示。在整个成像过程中跟踪显示的细胞数量，测量G1（红色）、进入S期（黄色）和S/G2（绿色）的长度。显示平均值（h）。另请参见相关图S4A。（C） 无有丝分裂时双生素降解的定量。如上所述对细胞进行处理和成像，并分析电影中是否有细胞在没有有丝分裂的情况下出现至少一次双生素降解。>对每种情况下的100个细胞进行评分。从4个独立实验中获得平均值和标准偏差。另请参见相关图S4。
图5
图5。Cdh1参与核复制
（A–C）敲除Cdh1抑制多倍体化。POT1a型前/后POT1b型前/后用shRNA处理MEFs以敲低Cdh1（（A）中的免疫印迹），并且在POT1a/b缺失后通过Cre表达、zeocin处理或在未处理的细胞中测量多倍体。显示了一个代表性实验（B）的FACS曲线和3个独立的SDs实验（C）中多倍体细胞百分比的量化。（D） Cdh1击倒后双生素降解减弱。POT1a公司前/后POT1b型前/后用FUCCI载体转导的MEF用Cre处理，然后在一天后用Cdh1 shRNA或载体控制感染。两天后，对细胞进行60小时的成像（电影S6），并显示一个典型实验的选定时间点。具有相同方向的箭头会随着时间的推移高亮显示相同的单元格。在Cre-treated细胞中，突出显示了两个具有代表性的细胞，它们在没有有丝分裂的情况下表现出双生蛋白降解。在用Cre和Cdh1 shRNA处理的细胞中，箭头突出显示了两个细胞，它们在G2中表现出长时间的停滞和双生素的持续存在。（E） 在用Cdh1 shRNA处理的POT1a/b DKO细胞上获得的FUCCI成像数据示意图。细胞按（D）处理和成像。仅用Cdh1 shRNA处理的细胞分别成像（电影S6）。在整个成像过程中跟踪显示的细胞数量，以确定G1（红色）、进入S期（黄色）和S/G2（绿色）的长度。显示平均值（h）。（F） 表中显示了Cdh1敲除对有丝分裂依赖性双生素降解的影响。细胞按（D）和（E）所示进行处理和成像。在整个电影中，至少跟踪了100个细胞，并测定了在没有有丝分裂的情况下，至少出现一次双生蛋白降解事件的细胞百分比。平均值和标准偏差是从3个独立实验中获得的。另请参见相关图S5。
图6
图6。四倍体化后细胞分裂周期的重建
（A） 实验方法示意图。H2B-GFP表达细胞POT1a前/后POT1b型前/后在Tet-Off诱导启动子的控制下，用POT1a转导的MEF用Cre处理并克隆。显示了一个克隆（#19）上的数据。用多西环素（doxy）抑制POT1a治疗7天后，用Hoechst和FACS对#19细胞进行染色，以检测DNA含量。分离G1二倍体细胞（2N峰）和G2四倍体细胞，在没有强力霉素的情况下进行电镀，并通过延时成像监测。（B） 强力霉素治疗后多倍体的诱导。在多西环素中放置7天后，通过FACS（PI染色）分析（A）中描述的克隆#19。（C） POT1a的可逆表达和DNA损伤信号的沉默。在分选的二倍体和四倍体细胞中，在多西环素处理3或5天后以及在其去除5天后（第12天）显示细胞系#19中所指示的蛋白质的免疫印迹。（D） POT1a再次表达后，来自克隆#19的二倍体和四倍体细胞的细胞分裂。脱除多西环素24小时后开始对表达H2B-GFP的二倍体和四倍体细胞进行延时成像。每15分钟拍摄一次相位对比和GFP荧光图像（电影S8）。显示选定的时间点。箭头高亮显示在成像会话期间执行多个单元分割的单元。插图显示多极有丝分裂的证据。
图7
图7。肿瘤中端粒驱动的四倍体模型
展示端粒损耗如何诱导四倍体的简化漫画。端粒磨损导致的端粒极短可能导致持续的DNA损伤反应。在p53缺陷细胞中，不会发生G1/S阻滞和对DNA损伤的衰老/凋亡反应。ATM/ATR激酶途径的激活将导致Cdk1/CyclinB的永久抑制，从而阻断有丝分裂。然后，细胞能够绕过有丝分裂并重新进入S期（由于APC/Cdh1降解双生素），成为四倍体。其中一些细胞可能携带二倍体染色体，如漫画所示。端粒功能的恢复需要端粒酶的激活或上调，从而沉默DNA损伤反应并允许四倍体克隆的增殖。
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