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.2010年4月；120(4):1217-28.
doi:10.1172/JCI39837。 Epub 2010年3月8日。

ERK1/2-Akt1串扰调节小鼠和斑马鱼的动脉生成

宾仁 1, 邓勇, Arpita Mukhopadhyay公司, 安东尼·拉纳汉, 郑维庄, 卡伦·穆迪, 玛丽·乔·穆利甘·凯霍, 塔蒂亚纳五世拜佐娃, 兰德尔·T·彼得森, 迈克尔·西蒙斯
附属公司

ERK1/2-Akt1串扰调节小鼠和斑马鱼的动脉生成

宾仁等。 临床研究杂志. 2010年4月.

摘要

动脉形态发生是一个重要的过程，但人们对此知之甚少。特别是，控制动脉形成的信号事件尚未确定。我们评估了ERK1/2和PI3K信号通路之间平衡的改变是否可以在小鼠和斑马鱼的动脉形态发生缺陷的情况下刺激动脉形成。通过下调PI3K活性，抑制Akt1而非Akt2表达，或引入具有组成活性的ERK1/2结构，在体外和体内实现了小鼠内皮细胞ERK1/2活性的增加和VEGF反应性的降低。这种ERK1/2活化的恢复足以恢复联结蛋白缺乏小鼠和联结蛋白敲除斑马鱼受损的动脉发育和分支形态发生。同样的方法有效地刺激了成年小鼠的动脉生长，恢复了缺乏联结蛋白的小鼠和同时缺乏LDL-R和ApoB48的动脉粥样硬化小鼠的动脉生成。因此，我们得出结论，PI3K-ERK1/2串扰在调节动脉生长中起着关键作用，通过抑制PI3K信号通路增强ERK信号可以有效刺激动脉生成。

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图1
图1。PI3K抑制激活了合成缺陷AEC和斑马鱼中的ERK信号。
(一个——E类)VEGF-A治疗后WT和连接蛋白缺失小鼠AECs的蛋白质印迹165体外试验。(一个)激活VEGFR2 Y1175显示的数据是VEGF刺激后10分钟。T-，总计。(B类)VEGF-A后ERK激活的时间进程165治疗。注意，合成素缺乏的AEC中ERK激活减少。(C类)VEGF-A后Akt激活的时间进程165治疗。注意，在联结素缺乏的AEC中AKT活化减少。(D类)通过抑制PI3K恢复ERK激活。在LY294002或GS4898浓度增加的情况下，用VEGF-A刺激缺乏协同素的AEC，10分钟后测试ERK的激活。注意ERK激活的剂量依赖性增加。(E类)通过PI3K抑制在联结素缺乏的AEC中ERK激活的时间进程。注意活动的长期恢复。(如果和G公司)斑马鱼胚胎中P-ERK1/2和ERK1/2总表达的分析。在1-ss时，胚胎被注射12 ng抗连接蛋白MOs或不治疗（NT）。8秒时，注射胚胎用20、50或100μM GS4898或DMSO作为对照。(如果)代表性Western blot。(G公司)P-ERK/T-ERK比值的定量分析。
图2
图2。PI3K抑制可恢复连接素缺乏型AEC中动脉标记物的表达。
(一个)合成缺陷AEC中的Akt1和Akt2基因敲除。用Akt1或Akt2特异性shRNA或对照shRNA处理缺乏协同素的AEC。24小时后，用25 ng/ml VEGF-a处理细胞10分钟后，进行Western blotting165注意Akt1击倒后ERK1/2信号的激活。(B类)使用特异性siRNA或非特异性序列作为对照，减少了合成素缺乏的AECs中PI3K亚单位p110α和p110β的表达。24小时后，用VEGF处理细胞，并在基线（0分钟）或5分钟时测定ERK激活。注意，用p110α或p110βsiRNA处理的细胞中ERK1/2激活增加(C类)协同素-空(n个=6）和Ldlr公司–/–ApoB48修饰小鼠(n个=12）通过植入的Alzet微型泵用GS4898治疗3天，然后注射VEGF-A。显示的是用于喂2和微管蛋白（负荷控制）仅暴露于VEDGF、GS4898或两者的组合的小鼠。票据减少喂2VEGF和GS4898组合后的激活。(D类)动脉标志物表达的定量PCR分析。协同素缺失小鼠(n个=6）按上述方法处理。定量PCR用于测定Hey2、ephrin B2和DLL4的表达*P（P）< 0.05, **P（P）与对照组相比<0.01。
图3
图3。部分PI3K抑制对联结素缺乏AEC的功能影响。
(一个)在改良的Boyden小室试验中评估细胞迁移。将缺乏协同素的AEC暴露于25 ng/ml VEGF-A的载体中165、4μM GS4898、VEGF和GS4898的组合，或在存在10μM U0126的情况下GS4898和VEGF的组合。使用载体或VEGF-A治疗WT AEC165迁移的程度表示为相对于车辆处理的合成缺陷AEC的比率。注意，在VEGF存在的情况下，暴露于GS4898的联凝集素缺乏型AECs的迁移完全恢复。(B类)三维胶原管分支分析。在25 ng/ml VEGF、4μM GS4898或两者同时存在的情况下，将缺乏协同素的AEC和WT AEC放置在3D胶原蛋白中。24小时后评估分支程度，并将其表示为相对于未经处理的对照联结蛋白缺乏型AEC的折叠变化。注意通过GS4898治疗恢复了合成素缺乏型AECs的分支。(C类和D类)体外基质。在生长因子缺失的Matrigel上放置缺乏连接素的AEC，并暴露于25 ng/ml VEGF-A，以评估脊髓分支的程度165、4μM GS4898、VEGF和GS4898的组合，或在存在10μM U0126的情况下GS4898和VEGF的组合。将暴露于VEGF的WT AEC作为对照。所有结果都是相对于未经治疗的对照组联结蛋白缺陷AECs表达的。注意通过GS4898治疗恢复了合成素缺乏型AECs的分支*P（P）< 0.05, **P（P）<0.001与对照组。比例尺：500μm。
图4
图4。ERK激活可恢复合成缺陷AEC的功能缺陷。
(一个和B类)用空的Ad载体、Ad-ME或Ad-ME-LA转导缺乏协同素的AEC。然后将转导的细胞接种在缺乏生长因子的Matrigel中，并暴露于25 ng/ml VEGF-A165如图所示。如图3所示，24小时后评估的脐带分支程度表示为相对于未经治疗的对照组联蛋白缺乏型AEC的折叠变化。注意在表达ME-LA结构的联结蛋白缺失的AECs中分支的恢复。比例尺：500μm。(C类)改良Boyden室中的细胞迁移。将如上所述处理的Synectin缺陷型或WT AECs放置在室中，并评估对VEGF的迁移程度。数值表示为相对于车辆处理的合成缺陷AEC的折叠变化。注意通过ME-LA构造恢复迁移*P（P）与病媒控制相比，<0.05。
图5
图5。体内ERK1/2活化的恢复可促进血管生成。
(一个)将含有溶媒对照物或100 ng/ml VEGF-A和肝素的DIVAA管放入synectin-null中(n个=8）或重量(n个=8）小鼠。注意，14天后，在存在VEGF的情况下，GS4898处理的联结蛋白完整小鼠中新生血管的恢复。(B类)体内Matrigel塞试验。将不含病毒或VEGF的对照塞子，或含有VEGF和Ad-ME或Ad-ME-LA病毒的塞子植入连接素缺乏小鼠体内(n个= 8). 将含有VEGF的基质胶塞植入WT小鼠作为对照(n个= 8). 注意，在连接素缺乏的小鼠中，VEGF和Ad-ME-LA塞子有广泛的新生血管形成。(C类和D类)VEGF诱导的VEGFR2磷酸化Ldlr公司–/–ApoB48修饰小鼠。Ldlr公司–/–ApoB48修饰小鼠在任一种食物上维持11周(n个=6）或高脂肪饮食(n个=6）腹腔注射VEGF-A（50 ng/ml），以及VEGFR2磷酸化程度（抗Y1175抗体）(C类)和ERK1/2磷酸化(D类)通过心脏（H）、肝脏（L）和骨骼肌（M）组织样本的Western blotting进行评估。注意VEGFR2 Y的激活减少1175和ERK1/2英寸Ldlr公司–/–ApoB48修饰的小鼠喂食高脂肪饮食。(E类和如果)外膜血管生成测定。广告无效控制(n个=6）或Ad-ME-LA(n个=6）将pluronic凝胶中的病毒添加到主动脉外膜表面Ldlr公司–/–ApoB48修饰的小鼠喂食高脂肪饮食。注意21天后用Ad-ME-LA病毒治疗的主动脉新生血管显著增加。比例尺：10μm*P（P）与对照组相比<0.05。
图6
图6。体内ERK1/2活化的恢复可促进动脉生成。
(一个——C类)股总动脉结扎在股总动脉连接处进行(n个=6）和重量(n个=6）小鼠，如前所述（15）。GS4898通过Alzet微型泵给药。(一个)右脚血流恢复的激光多普勒分析，表示为右脚与左脚的血流比率（R/L）。Synectin-null和WT小鼠接受载体或GS4898*P（P）<0.05，WT vs.联结蛋白。(B类)动脉结扎后14天进行典型的μCT检查。(C类)对连接素缺乏小鼠的μCT数据进行定量分析*P（P）与车辆相比<0.05。(D类和E类)12例进行股总动脉结扎Ldlr公司–/–ApoB48修饰小鼠接受11周的高脂肪饮食。一组通过Alzet微型泵（红色条；n个=6），而其他人收到车辆（蓝色条；n个= 6). 另一组年龄匹配Ldlr公司–/–ApoB48修饰的小鼠被保持在普通的食物上（黑色条；n个= 6). (D类)激光多普勒血流分析，以右后肢与左后肢的流量比表示*P（P）与车辆相比<0.05。(E类)典型的μCT图像。注意到GS4898治疗小鼠的动脉发育显著增加。比例尺：540μm。
图7
图7。体内ERK1/2激活的恢复可恢复斑马鱼的动脉生成。
(一个——E类)载药治疗斑马鱼胚胎动脉血管系统发育的低倍和高倍图像（WT；一个)，联凝集素MO(B类)，或合成蛋白MO加GS4898(C类)或LY294002(D类)，如方法中所述。比例尺：300μm。(E类)ISV形成的定量分析。P（P）数值与未经处理的对照组合成酶敲除进行了比较。(如果)MEK抑制对PI3K下调诱导的ISV形成的影响。用载体或联结蛋白MO处理的斑马鱼胚胎暴露于GS4898、LY294002或2浓度的U0126，如图所示。在WT胚胎中未观察到对ISV形成程度的影响，而联凝集素MO处理的胚胎对ISV形成表现出完全的抑制作用*P（P）< 0.0001; **P（P）= 0.0005. (G公司)PI3K/Akty1-Raf1/ER1/2串扰模式。有关详细信息，请参阅文本。
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