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.2010年3月12日；86(3):378-88.
doi:10.1016/j.ajhg.2010.01.30。 Epub 2010年2月18日。

靶向捕获和下一代测序确定编码taperin的C9orf75是非综合征性耳聋DFNB79的突变基因

证明Ur Rehman 1, 罗伯特·莫雷尔, Inna A Belyantseva酒店, 沙希德·伊·汗, 埃里希·托·博格, 莫辛·沙哈扎德, 祖拜尔·M·艾哈迈德, 赛马·里阿祖丁, 沙欣·N·汗, 谢赫·里阿祖丁, 托马斯·弗里德曼
附属公司

靶向捕获和下一代测序确定编码taperin的C9orf75是非综合征性耳聋DFNB79的突变基因

Atteeq Ur Rehman公司等。 美国人类遗传学杂志. .

摘要

利用靶向基因组捕获结合下一代测序分析9q34.3号染色体上2.9Mb的DFNB79区间，其中包括108个候选基因。来自分离隐性、非综合征性耳聋的近亲家族受影响成员的基因组DNA被用于构建一个片段库，涵盖四个家系的遗传分析确定的DFNB79连锁区间。通过评估402554个测序读数的文库，检测到转录序列中8个先前未报告的变体的纯合性，随后通过Sanger测序进行了确认。在这些变异体中，有六个在巴基斯坦人群中被确定为多态性，一个在非编码基因中，该基因随后被排除在DFNB79连锁区间之外。剩下的变异是预测基因C9orf75中的无义突变，该基因重命名为TPRN。对其他三个DFNB79连锁家族的评估发现了三个额外的移码突变，共有四个该基因的截断等位基因。尽管TPRN在许多组织中表达，但小鼠耳蜗中蛋白产物的免疫定位显示，在毛细胞静纤毛的锥度区域有显著表达。因此，我们将该蛋白命名为taperin。

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数字

图1
图1
DFNB79型-显示致病性变体（A）的连锁家系和序列追踪从PKDF741家族受影响个体IV-4中选择用于捕获和富集来自DFNB79型基因座和下一代测序。每个谱系中的填充符号代表受影响的个体。女性（圆圈）和男性（方块）符号右上角的圆点表示其DNA序列为TPRN（TPRN）通过双脱氧终端化学测定。DNA序列下方的横线表示核苷酸发生了改变。在PKDF280家族中，来自受影响个体的序列追踪显示纯合11 bp重复。在PKDF1129家族的受影响个体中，虚线表示11bp缺失的位置。NCBI参考序列（NM_001128228.1用于核苷酸变化，NP_001121700用于氨基酸变化）分别用于指示cDNA和蛋白质的突变位置。（B） 在PKDF1129和PKDF280家族的受影响成员中发现的11 bp缺失和11 bp重复分别发生在野生型中已经重复的序列中。
图2
图2
下一代测序发现的变量摘要常规字体的值是至少三个非重复正向和反向454读或至少五个质量分数大于20（或30，如果差异涉及五聚体或更大）的单向读支持的变量。粗体值仅限于在该位置映射的至少85%的读取所支持的变体。缩写如下：UTR，未翻译区域；短串联重复序列；单核苷酸多态性。一Sanger测序显示假阳性。
图3
图3
NimbleGen探针覆盖范围和序列覆盖范围TPRN（TPRN），中发现的四种致病性变体的GC含量和位置DFNB79型-链接族大约10 kb的跨度TPRN（TPRN）在2.9 Mb中DFNB79型显示间隔。垂直线对应于五基窗口中的GC内容。上部的黑色条表示探针覆盖范围（平铺区域）TPRN（TPRN）。获得454序列的区域显示在下方的条形图中。请注意，在外显子1中，一个878 bp的区域（具有81%GC含量）没有测序，即使它被拼接在NimbleGen阵列上。我们从四个家族成员的基因组DNA扩增的PCR产物中确定了这个GC丰富区域的序列DFNB79型-用双脱氧端化物化学方法连锁家系。灰色粗条、连接它们的线条和灰色细条分别代表外显子、内含子和3′UTRTPRN（TPRN）参见表S3。
图4
图4
人9q染色体部分与小鼠2号染色体的保守同步性及其表达谱TPRN（TPRN）在几个组织中（A）人类染色体9q的一部分，端粒末端的17.71 Mb，与小鼠2号染色体的14.62 Mb同步，也包括2.9 Mb的DFNB79型联动间隔。两个染色体片段之间的垂直线（未按比例绘制）显示了共有区，在染色体两侧各有五个紧密相连的同源基因DFNB79型基因。根据保守的共线性和序列比较（见图5），C430004E15瑞克是人类的小鼠直系亲属TPRN（TPRN）.（B）箭头表示用于放大C430004E15瑞克来自小鼠多组织cDNA文库的转录物。预期的cDNA和gDNA产物大小分别为2.4 kb和6.9 kb。扩增序列得到确认。
图5
图5
人类编码氨基酸预测序列的ClustalW比对TPRN（TPRN）其小鼠Ortholog C430004E15Rik Taperin（711个残基，Ensembl，ENSP00000387100）与从基因组DNA推导并经cDNA测序证实的749个氨基酸的同源小鼠预测蛋白具有68%的同源性和75%的相似性。位于黑色、灰色和白色块中的残留物分别是相同、相似和不匹配的，而点表示间隙。黑色三角形顶部的“M”是预测人类锥变蛋白的平移起始位点（参考序列号，NP_001121700）。请注意，额外的N末端61残基在小鼠同源基因中高度保守。红色三角形指向第一个受影响的氨基酸，这是由于一个无义突变和三个移码突变在四个氨基酸中分离所致DFNB79型-相关系谱。矩形图概述了人类蛋白残基的保存情况，这些残基被用作针对taperin的商用抗体（Sigma-Aldrich）的免疫原，我们使用tapelin对小鼠内耳组织进行免疫染色。另请参见图S1，以了解锥蛋白与多物种的ClustalW比对。
图6
图6
用含有GFP标记的全长小鼠Taperin表位cDNA构建物的表达载体转染的内耳感觉上皮（A）COS7细胞中Taperin的抗体验证和免疫定位。（B和C）GFP-taperin-转染COS7细胞的taperin抗体染色。抗体免疫荧光信号（红色）与GFP-taperin共定位。（D）COS7细胞转染全长GFP-phostensin（绿色）并用taperin-抗体染色（红色）。未观察到共定位信号，表明taperin抗体与phostensin无交叉反应。小鼠皮层器官和前庭感觉上皮中的（E–H）罗丹明-球蛋白（红色）突出了静纤毛核心的丝状肌动蛋白、毛细胞角质板以及非感觉细胞的细胞骨架。（E） P7小鼠皮层网状层表面器官的光学切片。锥蛋白（绿色）位于外毛细胞（OHC）和内毛细胞（IHC）的每个立体纤毛的底部，位于富含肌动蛋白的角质板的顶部。插图显示了OHC顶端表面的高分辨率图像，锥体蛋白（绿色）位于所有三行的每个立体纤毛的底部附近。支持细胞（SC）中也存在锥蛋白免疫反应。感觉上皮外的内沟细胞和其他细胞类型具有较弱或无明显的绒毡层蛋白免疫反应。（F） 锥蛋白（绿色）存在于小鼠球囊感觉上皮中前庭毛细胞（VHC）每个立体纤毛（箭头）底部的锥状区域。IHC静纤毛的（G和H）高分辨率图像显示，绒毡层蛋白沿P7（G）和P45（H）毛细胞顶面静纤毛基底附近的锥形区域有明显的定位（箭头）。（C）和（D）中的比例尺代表20μm，（E–H）中的标尺代表5μm。人绒毡层蛋白和人光敏蛋白的ClustalW比对见图S2。
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