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。2010年3月；16(3):286-94.
doi:10.1038/nm.2100。 Epub 2010年2月14日。

癌基因-肿瘤抑制级联通过协同激活Ras和核因子-kappaB驱动转移性前列腺癌

闵俊霞 1, 亚历山大·扎斯拉夫斯基, 朱塞佩·费德勒, 萨拉·麦克劳林, 伊丽莎白·雷泽克（Elizabeth E Reczek）, 托马斯·德·雷德特, 伊西尔·古尼, 大卫·E·斯特罗奇利克, 劳拉·麦克奈尔, 拉明·贝鲁金, 罗德里克·布朗森, 桑德拉·莱姆, 威廉·C·哈恩, 马西莫·洛达, 凯伦·齐卓斯基
附属机构

癌基因-肿瘤抑制级联通过协同激活Ras和核因子-kappaB驱动转移性前列腺癌

闵俊霞等。 自然·医学。 2010年3月。

勘误表in

摘要

转移是大多数前列腺癌相关死亡的原因；然而，对这一过程的分子机制知之甚少。在此，我们确定了一种癌基因-肿瘤抑制级联反应，通过协调激活小GTPase Ras和核因子-kappaB（NF-kappa B）促进前列腺癌生长和转移。具体而言，我们发现Ras GTPase激活蛋白（RasGAP）基因DAB2IP的缺失在原位小鼠肿瘤模型中诱导前列腺癌转移。值得注意的是，DAB2IP作为一种信号支架，通过不同的结构域协调调节Ras和NF-kappaB，分别促进肿瘤生长和转移。DAB2IP在人类前列腺癌中被抑制，其表达与肿瘤分级呈负相关，并可预测预后。此外，我们报道DAB2IP的表观遗传沉默是多梳组蛋白组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶EZH2激活Ras和NF-kappaB并触发转移的关键机制。这些研究确定了转移性前列腺癌中两条主要通路同时激活的机制，并确定EZH2是转移的驱动因素。

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数字

图1
图1。DAB2IP抑制诱导前列腺肿瘤的发生
（a）慢病毒shRNA表达后，免疫印迹显示E1A和DNp53表达的MEF中NF1、DAB2IP或p120RasGAP的表达（左）。软琼脂中菌落形成（右）。显著性由学生t检验确定。(P（P）= 3.7 × 10−8,P（P）= 8.6 × 10−9).（b）因菌落丢失而导致的菌落相对大小DAB2IP（数字音频广播）与NF1型通过学生t检验确定显著性。(P（P）=.046）（c）感染表达慢病毒的永生化PrEC细胞的集落形成DAB2IP（数字音频广播）shRNA序列。（d）c细胞的免疫印迹以评估DAB2IP敲除和Ras、ERK和AKT的激活，如方法中所述。（e）菌落生长诱导因素DAB2IP（数字音频广播）-使用指向3′UTR的shRNA进行抑制，或使用野生型DAB2IP进行拯救。（f）用于评估DAB2IP表达和Ras、ERK和AKT激活的细胞免疫印迹。（g）原位注射PrEC引起的肿瘤的组织学显微照片。顶行：苏木精和伊红（H&E），中行：LgT免疫组化，底行：Ki67染色。注：第一列图像表示一只动物的前列腺组织，其对照病变已退化。第二列图像来自一个小的对照病变。最后一列来自前列腺，其中一个“挽救”的病变已经消退。（h）H-Ras的免疫组织化学染色V12版本以及使用细胞角蛋白8、p63和PSA抗体的DAB2IP缺陷肿瘤。（i）原位肿瘤随时间变化的体积，通过异种显像计算（学生t检验（p=0.13））。（j）死亡时原位肿瘤的最终重量（学生t检验（p=0.34）。所有标尺=200μM。
图2
图2。DAB2IP缺失，但非H-RasV12版本促进侵袭和广泛转移
（a）注射H-Ras的小鼠原发性肿瘤的组织学显微照片V12版本-表达PrEC细胞。比例尺=5mm。（b）注射DAB2IP（数字音频广播）-缺乏PrEC细胞。第二组显示了使用LgT抗体的免疫组织化学。比例尺=5mm，除腰肌和膀胱外，比例尺=1mm。（c）注射DAB2IP缺陷型PrEC细胞的小鼠转移瘤的组织学显微照片。在相邻切片上使用LgT抗体的免疫组织化学在每个转移瘤下方显示高倍，但淋巴结除外，淋巴结上显示H&E染色。比例尺（肝脏和SV）=5mM；（LN、睾丸、VD）=1nM。（d）血管（BV和箭头）和淋巴管（LV）内含有肿瘤细胞（T）的组织的H&E染色切片。当由线条指定时，会显示放大倍数更高的图像。两个面板显示LgT染色。比例尺（面板1、2、4）=1 mM；（面板3、5、6）=200μM。（e）原位注射表达荧光素酶的对照、DAB2IP缺陷或H-Ras的小鼠的异种图像V12版本-表达细胞。（f）DAB2IP缺陷动物与H-Ras的存活曲线第12版-表达肿瘤。
图3
图3。DAB2IP的RasGAP活性是其部分但非全部肿瘤/转移抑制功能的基础
（a）免疫印迹比较表达野生型DAB2IP或DAB2IP-R289L的PrEC、PC-3和PC-3细胞中DAB2IP的表达。（b）免疫印迹评估DAB2IP和DAB2IP-R289L对PC-3中Ras、ERK和AKT激活的影响，如方法中所述（c）小鼠注射a和b的PC-3细胞的异种基因图像。（d）通过Xenogen图像计算PC-3衍生肿瘤的体积。（e）点图描绘了注射表达野生型DAB2IP或DAB2IP-R289L的PC-3细胞的动物中每只小鼠的转移数量。（f）DAB2IP免疫印迹对应于e。（g）（左）显示PrEC肿瘤最终重量的条形图。（右）描绘注射表达PrEC细胞的动物中每只小鼠的转移数量的点图DAB2IP（数字音频广播）shRNA1或2单独或与野生型或DAB2IP-R289L一起使用。（Mann-Whitney U；P（P）= 0.0030)（h）（左面板顶行）表达慢病毒载体控制、DAB2IP特异性shRNA或活化Ras等位基因的永生化PrEC细胞的相图像。（中排，左面板）间充质标记物波形蛋白或（下排，左板）上皮标记物E-cadherin的免疫荧光染色。（中面板）免疫印迹检测DAB2IP、异位Ras、纤维连接蛋白、波形蛋白、E-cadherin的表达。（右面板）进行实时PCR以量化波形蛋白、E-cadherin和扭转表达，以响应DAB2IP缺失或激活的Ras等位基因。（i）DAB2IP缺陷或H-Ras中波形蛋白（绿色）和E-钙粘蛋白（红色）免疫荧光染色的共焦图像V12版本-表达肿瘤。所有标尺=100μM。
图4
图4。DAB2IP（数字音频广播）-缺失通过对Ras和NF-κB的伴随作用促进肿瘤发生和转移
（a）（左）在PrEC细胞中，NF-κB活性被报道为相对荧光素酶单位（RLU），以响应DAB2IP抑制。（中间）NF-κB活性对PC-3细胞中DAB2IP重建的反应。（右）DAB2IP免疫印迹。（b）Q-PCR测定在不含TNF-α的情况下，在含有和不含DAB2IP shRNA的PrEC细胞中NF-κB靶点的表达，（c）在TNF-α存在的情况下，通过Q-PCR在具有和不具有DAB2IP cDNA的PC-3细胞中测定NF-κB靶标的表达。（d）重组PC-3细胞的DAB2IP免疫印迹。IκB超表达如补充图7b所示。（e）根据异种图像计算PC-3细胞的肿瘤体积。（f）描绘在每只注射PC-3细胞的小鼠中检测到的转移数量的点图。（g）小鼠注射来自d-f的PC-3细胞的异种基因图像。上述Ras和NF-κB状态总结了表达突变体的生化效应。图像下方的数字表示发生转移的动物数量/注射的动物数量。（h）来自对照PrEC细胞、带有3′UTR shRNA（3′UTRs）的PrEC电池、用DAB2IP（cDNA）或S604A突变体重建的3′UTR-细胞的肿瘤最终重量。表达式被确定为等效（未显示）。（i）描绘每只小鼠注射PrEC细胞后h内检测到的转移瘤数量的点图。（j）使用识别DAB2IP缺陷和H-Ras中NF-κB、pERK和pAKT的抗体进行免疫组织化学V12版本-表达肿瘤。比例尺=200μM。
图5
图5。EZH2通过抑制DAB2IP（数字音频广播）
（a）原位注射表达EZH2的PrEC细胞的肿瘤和转移的组织学图像。在淋巴管（LV）和血管（BV）内观察到肿瘤细胞，呈圆形。所有动物的转移数据见补充表1。（b）（左）表达载体控制或EZH2的永生化PrEC细胞的DAB2IP免疫印迹。顶级乐队是EZH2。（右）用异位DAB2IP-V5重建的b细胞的免疫印迹。（c）实时PCR测定EZH2对内源性DAB2IP mRNA表达的抑制。（d）结合DAB2IP启动子的EZH2染色质免疫沉淀。（e）根据注射表达EZH2或EZH2和DAB2IP的细胞的动物的异种图像计算肿瘤体积。（f）描绘在注射表达EZH2或表达EZH2/DAB2IP的PrEC细胞的每只小鼠中检测到的转移数量的点图。（g）小鼠原位注射表达EZH2或表达EZH2/DAB2IP的PrEC细胞后的存活曲线。（h）使用p-ERK、p-AKT和NF-κb（p50）抗体对EZH2-表达或EZH2/DAB2IP表达的PrEC衍生肿瘤进行免疫组化。（右侧面板）。使用人类波形蛋白（绿色）e-cadherin（红色）抗体对EZH2-表达或EZH2/DAB2IP表达的PrEC衍生肿瘤进行共焦免疫荧光成像。（i）免疫印迹评估EZH2和DAB2IP重建对PrEC细胞Ras、ERK和AKT激活的影响，如方法所述（j）注射i所示细胞的小鼠中检测到的肿瘤最终重量和转移数量。所有标尺=200μM，共焦图像除外，其中标尺=100μM。
图6
图6。DAB2IP在人类前列腺癌中被抑制
（a）EZH2如何调节DAB2IP、Ras和NF-κB促进肿瘤发展和转移的模型。（b）正常小鼠前列腺、DAB2IP缺陷的PrEC衍生肿瘤或Ras-driven肿瘤的DAB2IP免疫组织化学染色。（c）（上图）正常人前列腺上皮中DAB2IP抗体的免疫组织化学染色。（底部）同一活检组织中正常人体组织和邻近肿瘤组织（T）的免疫组织化学DAB2IP染色。（d）人前列腺癌组织中DAB2IP抗体的免疫组织化学染色。（右）图像的高倍放大。箭头表示基质细胞。（e）前列腺上皮内瘤变（PIN）和前列腺癌（PCa）与良性前列腺组织中DAB2IP蛋白表达的直方图(P（P）= 1.8 × 10−27).（f）比较DAB2IP表达和Gleason等级（非分数）的直方图，评估为每个核心上最普遍的模式(P（P）= 0.001). 由于阵列上的组织切片相对较小，因此他们被指定为Gleason分级（1-5），而不是Gleason评分（1-10），后者代表整个肿瘤中两个最常见分级的总和。因此，4级和5级肿瘤是高级肿瘤。（g）前列腺癌与正常组织DAB2IP mRNA表达数据的方框图(P（P）= 2.0 × 10−7)在高级别肿瘤中，而不是低级别良性组织中(P（P）= 0.003).（h，i）的表达式DAB2IP（数字音频广播）单个肿瘤和转移病灶中EZH2水平的对比。所有标尺=400μM。
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