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.2010年2月2日；107(5):2037-42.
doi:10.1073/pnas.0914433107。 Epub 2010年1月19日。

抑制乳酸脱氢酶A诱导氧化应激并抑制肿瘤进展

安妮·勒 1, 查尔斯·库珀, 阿文·M·高, 拉马尼·迪纳瓦希, 阿尼尔班·迈特拉, 洛林M甲板, 罗伯特·罗伊尔, 大卫·L·范德雅格特, 格雷格·塞门扎, 池V当
附属公司

抑制乳酸脱氢酶A诱导氧化应激并抑制肿瘤进展

安妮·勒等人。 美国国家科学院程序. .

摘要

由于基因改变和肿瘤缺氧，许多癌细胞贪婪地摄取葡萄糖并通过乳酸脱氢酶A（LDHA）生成乳酸，LDHA由c-Myc和缺氧诱导因子（HIF-1）的靶基因编码。以往关于LDHA表达降低的研究表明，LDHA参与肿瘤的发生，但其在肿瘤维持和进展中的作用尚未确定。此外，通过干扰或反义RNA降低LDHA表达如何抑制肿瘤发生尚不清楚。在这里，我们报告了通过siRNA减少LDHA或通过小分子抑制剂（FX11[3-二羟基-6-甲基-7-（苯甲基）-4-丙基萘-1-羧酸]）抑制LDHA降低ATP水平并诱导显著的氧化应激和细胞死亡，抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸可部分逆转这一现象。此外，我们发现FX11抑制了大规模人类淋巴瘤和胰腺癌异种移植物的进展。当与NAD（+）合成抑制剂FK866联合使用时，FX11诱导淋巴瘤消退。因此，用FX11抑制LDHA对LDHA依赖性肿瘤是一种可行且耐受的治疗方法。我们的研究记录了Warburg效应的治疗方法，并证明癌症的氧化应激和代谢表型是癌症生物学的关键方面，需要考虑癌症能量代谢的治疗靶向。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。C.V.D.是Agios Pharmaceuticals科学咨询委员会成员；没有涉及该公司的赞助研究或技术许可活动。与这项工作有关的一项发明被报告给了约翰·霍普金斯技术转移办公室。

数字

图1。
图1。
siRNA降低LDHA表达导致P493人淋巴瘤B细胞耗氧量增加和氧化应激诱导的细胞死亡。通过电穿孔转染靶向人LDHA的siRNAs（SMARTpool），以瞬时降低LDHA的表达。(A类)对全细胞裂解物进行免疫印迹，用兔单克隆抗LDHA进行探测，并用抗α-微管蛋白作为负荷对照。(B类)在用siLDHA（斜率=−1.7）或siControl（斜率=−0.7）转染后72小时，通过使用克拉克型氧电极测定P493细胞的耗氧量。(C)用DCFDA荧光检测细胞内ROS的产生，并在有无NAC的情况下用siLDHA或siControl转染后72小时用流式细胞仪监测。(D类)在NAC存在或不存在的情况下，用siLDHA或siControl转染细胞后96 h，通过流式细胞术检测annexin V-和7-AAD染色细胞的细胞死亡（转染24 h后加入20 mM）。每个图中的数字表示死亡细胞的平均百分比（±SEM）。与对照组相比，用siLDHA处理的死亡细胞数量对使用学生的t吨测试；与siLDHA组相比，接受siLDHA和NAC治疗的患者具有对值为0.001。(E类)siControl细胞与经siLDHA处理的细胞相比，在转染后24小时开始每天添加5 mM NAC，在有或无条件下生长。siControl与siLDHA以及siLDHA与siLDHA+NAC在第4天的相对细胞数对值分别为0.008和0.004。对于siControl与siControl+NAC对值为0.63。
图2。
图2。
FX11抑制LDHA导致耗氧量增加、ROS生成和细胞死亡。(A类)在FX11存在（斜率=−2.4）和不存在（斜度=−1.7）的情况下，通过克拉克型氧电极测定P493细胞的耗氧量。数据代表重复实验。(B类)用DCFDA荧光法测定FX11或FK866处理的P493细胞的ROS水平。数据代表两个单独实验的三份样品。(C)与对照组相比，FX11治疗24小时后通过流式细胞术检测Annexin V和7-AAD染色细胞的细胞死亡。每个图中的数字表示死亡细胞的平均百分比。与对照组相比，FX11处理的细胞具有对值8.92e-06。(D类和E类)与FX11或FK866处理的细胞相比，在有或无20 mM NAC的情况下，对照细胞的细胞群增长。所有细胞在1×10的条件下生长5细胞/mL。细胞计数一式三份，显示为平均值±SD，重复整个实验，结果相似。
图3。
图3。
(A类)FK866增强FX11诱导的线粒体膜电位损失。用对照载体FK866、FX11或这两种抑制剂处理的P493细胞用JC-1染色并进行流式细胞术分析，FL2代表红色荧光强度，FL1代表绿色荧光强度，这反映了线粒体膜减少的细胞。每个面板中显示了膜电位降低的细胞的平均百分比（±SEM）。这个对将FX11处理的细胞、FK866处理的细胞或两者均处理的细胞与对照组进行比较时，值分别为0.03、0.002和0.0008。(B类)FK866和FX11对P493-6细胞增殖的影响。使用台盼蓝染料排除法对活细胞进行计数。数据显示为三份样品的平均值±SD。(C)FX11或FK866对ATP水平的影响。用9μM FX11或0.5 nM FK866处理P493细胞20小时并计数。ATP水平（平均值±SEM，n个=5个实验），通过基于荧光素-荧光素酶的分析，对含有等量活细胞的等分样品进行测定*对= 0.008; **对= 0.003. (D类)FX11或FK866处理的细胞裂解液中磷蛋白-AMP激酶（PAMPK）的免疫印迹。Tubulin用作加载控制。AICAR是一种激活AMPK的AMP类似物，被用作阳性对照。(E类)FX11增加NADH/NAD+比率。NADH/NAD公司+与溶媒对照组相比，用9μM FX11处理24小时的P493细胞的比率*对= 0.028. (F类)FX11抑制乳酸生成。与对照相比，用9μM FX11或0.5 nM FK866处理24小时的P493人B细胞培养基中的乳酸水平。对照RPMI含有10.7 mmol/L的葡萄糖，没有检测到乳酸*对=6.9E-06。
图4。
图4。
FX11作为抗肿瘤药物的体内疗效。(A类)免疫组织化学染色检测脾、肝和P493淋巴瘤的缺氧区域（深棕色）。(B类)FX11对可触及的人P493 B细胞异种移植物生长的影响。对照组动物每天腹腔注射载体（2%（vol/vol）DMSO），多西环素（0.8 mg/天）作为阳性对照，因为它抑制P493细胞中Myc的表达和肿瘤发生。(C)与对照组或化合物E（一种弱LDHA抑制剂）相比，FX11和/或FK866每日治疗对已建立的人类淋巴瘤异种移植物的影响。(插入)用对照药物或FX11治疗的代表性动物的照片。(D类)与化合物E相比，FX11抑制P198人胰腺癌异种移植瘤7P493细胞或5×106将P198细胞分别皮下注射到SCID小鼠或裸鼠体内。当肿瘤体积达到200mm时三每天腹腔注射42μg FX11和/或100μg FK866，观察10–14天。每4天使用数字卡尺测量肿瘤体积，并使用以下公式计算：[长度（mm）×宽度（mm）x宽度（mm”）×0.52]。结果代表平均±SEM。
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