The RAD23 family provides an essential connection between the 26S proteasome and ubiquitylated proteins in Arabidopsis

doi:10.1105/tpc.109.072660

.2010年1月；22(1):124-42.

doi:10.1105/tpc.109.072660。 Epub 2010年1月19日。

RAD23家族在拟南芥的26S蛋白酶体和泛素化蛋白质之间提供了一个重要的连接

丽莎·M·法默¹, 亚当J书, Kwang-Hee Lee（李光熙）, 林亚玲, 傅洪勇, 理查德·德维斯特拉

附属公司

PMID： 20086187
预防性维修识别码：项目经理2828702
内政部： 10.1105/tpc.109.072660

RAD23家族在拟南芥的26S蛋白酶体和泛素化蛋白质之间提供了一个重要的连接

丽莎·M·法默等。植物细胞. 2010年1月.

.2010年1月；22(1):124-42.

doi:10.105/tpc.109.072660。 Epub 2010年1月19日。

作者

丽莎·M·法默¹, 亚当J书, 李光熙, 林亚玲, 傅洪勇, 理查德·德维斯特拉

附属

¹威斯康星大学遗传学系，美国威斯康星州麦迪逊53706。

PMID： 20086187
预防性维修识别码：项目经理2828702
内政部： 10.1105/tpc.109.072660

摘要

泛素（Ub）/26S蛋白酶体系统（UPS）指导许多调节蛋白的周转，从而控制植物生长、发育和生存的许多方面。UPS部分由一组Ub-like/Ub-associated（UBL/UBA）蛋白质引导，这些蛋白质帮助泛素化蛋白质穿梭到26S蛋白酶体进行分解。在这里，我们描述了拟南芥UBL/UBA蛋白的收集，包括组成辐射敏感性23（RAD23）家族的四种亚型。富含核的RAD23蛋白通过UBA结构域结合Ub结合物，特别是那些通过Lys-48内部连接的结合物，并通过其N-末端UBL结构域与26S蛋白酶体Ub受体RPN10结合。虽然单独影响四个RAD23基因的纯合子突变体没有表型后果（rad23a、rad23c和rad23d）或诱导轻度叶芽固定和不育缺陷（RAD23 b），但高阶突变体组合产生严重矮化植株，四个突变体表现出生殖致死性。rad23b-1 rpn10-1组合的协同效应和rad23b植物对丝裂霉素C的反应都表明rad23b调节细胞分裂。综上所述，RAD23蛋白通过将UPS底物输送至26S蛋白酶体，在植物的细胞周期、形态和育性中发挥着重要作用。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
的域体系结构*拟南芥*UBL/UBA蛋白质类。**（A）**RAD23a、DSK2a、DDI1、NUB1和UBL1的蛋白质结构域组织。右边的数字表示每个蛋白质的氨基酸长度。STI，应力诱导-1结构域；RVP，逆转录病毒天冬氨酸蛋白酶结构域。**（B）**UBL结构域与Ub的氨基酸序列比对。箭头表示Ub中用于聚-Ub链组装的保守Lys残基。星号识别形成RPN10结合所需的Ub（Leu-8、Ile-44和Val-70）疏水补丁的残基。**（C）**UBA结构域的氨基酸序列比对。对于RAD23a-d和NUB1，显示了两个UBA序列。钻石识别促进UBA-Ub结合的疏水性MGF环（Met-Gly-Phe）残基。对于**（B）**和**（C）**，黑色和灰色方框分别表示保守残基和类似残基。点表示间隙。左右两侧的数字表示每个序列的氨基酸位置。

**图2。**
基因表达模式与蛋白质定位*拟南芥*RAD23等容线。**（A）**相对转录物丰度*RAD23a-d型*根据GENEVESTIGATOR DNA微阵列数据集确定的各种组织中(https://www.genefestigator.ethz.ch). EST数据库中的代表数量(网址：www.Arabidopsis.org)为每个轨迹列出。Juv，少年；垫子，成熟；森，衰老。误差条表示东南方来自不同的数组。**（B）**检测富含核（N）和细胞质（Cy）的组分中的RAD23、DSK2和DDI1蛋白。通过Percoll梯度离心法从1周龄野生型幼苗中制备组分，并使用所示抗体进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。β1亚基；RPN5，RP的盖亚基；RPN10和RPN1是RP的基本亚单位。分别使用针对WIP-1、组蛋白H3（H3）、PUX1和SUMO1的抗体来验证核和细胞溶质部分的富集。在每条车道上分析等量的总蛋白。Cr，粗提取物。**（C）**到**（F）**完整幼苗中RAD23b与GFP融合的亚细胞定位。**（C）**转基因的免疫印迹分析*雷达23b-1*稳定表达的植物*35S-GFP-RAD23b型*粗幼苗提取物用抗RAD23b和抗GFP抗体进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。填充箭头表示GFP-RAD23b，开放箭头表示RAD23b，星号表示自由GFP。*GFP公司*代表仅表达GFP的野生型植物。用抗PBA1抗体的免疫印迹分析验证了蛋白质负荷相等。**（D）**救援*雷达23b-1*通过*35S-GFP-RAD23b型*转基因。显示了具有指定基因型的十四日龄植物。**（E）**2周龄根尖细胞的共焦荧光显微镜观察*35S-GFP-RAD23b拉德23b-1*和*GFP公司*植物。箭头识别细胞核。棒材=5μm。**（F）**瞬时表达GFP-RAD23a-d的亚细胞定位*35秒*原生质体中的启动子。从2周龄叶片中制备原生质体，并在转染单独编码GFP的质粒或融合到每个RAD23亚型后24小时通过共焦荧光显微镜成像。绿色，GFP；红色，叶绿体。箭头识别细胞核。棒材=5μm。

**图3。**
*拟南芥*RAD23优先结合Lys-48–连接的聚-Ub链和Ub-共轭物。**（A）**体外聚-Ub链结合。通过Lys-48（K48）或Lys-63（K63）连接的Ub和多-Ub链的混合物与融合到RAD23b、RAD23c和RAD23d的重组GST或GST孵育，并用谷胱甘肽珠沉淀。通过SDS-PAGE解析Ub部分，并通过抗Ub抗体的免疫印迹分析进行检测。左侧面板，Ub混合物添加到反应中。右上面板，用RAD23蛋白恢复poly-Ub链。右下面板，每个下拉分析中使用的GST或GST-RAD23的量，如考马斯蓝染色凝胶所示。箭头显示不同长度的Ub和Ub聚合物以及RAD23-GST和GST蛋白质的迁移。**（B）**野生型RAD23结合蛋白的Co-IP拟南芥使用抗RAD23b抗体的幼苗。1周龄幼苗的粗提取物（Cr）单独与蛋白A珠孵育或用抗RAD23b免疫球蛋白修饰。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析，使用针对Ub、RAD23b、RPN10、DSK2a、DDI1和PBA1的抗体分析沉淀部分。抗-UBC1抗体被用作非特异性结合的对照。指出了Ub单体、自由聚-Ub链和Ub蛋白结合物的位置。

**图4。**
*拟南芥*RAD23蛋白质与26S蛋白酶体相互作用**（A）**RAD23与26S蛋白酶体的共提纯。PAG1亚基*拟南芥*CP被Flag表位标记版本取代，并用于用抗Flag抗体从粗幼苗提取物中富集26S蛋白酶体。如有指示，包括ATP以保持CP和RP子复合物的关联。免疫沉淀物来自*PAG1-标签第1-1页*并用抗RAD23b、DSK2a和DDI1以及26S蛋白酶体的RPN10、RPN1a和PBA1亚基的抗体对野生型植物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。**（B）**来自野生型幼苗的Ub结合物和RAD23的Co-IP使用来自*拟南芥*RPN10。将粗提取物（Cr）与装饰有GST或GST融合到UIM的谷胱甘肽珠孵育。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析，使用针对Ub、RAD23b、DSK2a、DDI1和PBA1的抗体分析沉淀部分。指出了Ub、自由聚-Ub链和Ub共轭物的迁移位置。

**图5。**
组织*拟南芥* *RAD23型*基因和描述*雷达23*突变。**（A）**Diagrams of theRAD23a型,*RAD23b型*,*RAD23c型*、和*RAD23d型*基因。方框和线条分别表示蛋白质编码区和内含子。黑盒，UBA域；交叉阴影框，UBL域；灰色方框，应力诱导1（STI1）域。图中显示了各种T-DNA插入的位置。箭头确定了图6A中用于RT-PCR分析的引物的位置。**（B）**的影响*放射性23a-1*T-DNA插入*RAD23a型*打开阅读框。的核苷酸序列*放射性23a-1*ATG起始密码子下游与野生型对齐*RAD23a型*顺序。这些框定位每个蛋白质的预测N-末端Met。括号界定了由*放射性23a-1*插入。引入的无义密码子（星号）带有下划线。**（C）**Ub的球棒式三维结构突出了rad23a-1蛋白中预计缺失的区域。β-股为浅灰色，随机线圈为深灰色，α螺旋为黑色。箭头指示T-DNA插入在编码序列中的位置*放射性23a-1*基因。粗线表示为rad23a-1 UBL预测的删除序列，框中标识预期的N端Met（M），Met-24。指出了Ub和RAD23a-d以及Ub中N端Met（M1）和C端Gly（G76）之间保守的Lys残基（K）的位置。

**图6。**
的分子和生物化学描述*拟南芥* *雷达23*突变体。**（A）**RT-PCR分析*放射性23a-1*,*雷达23b-1*,*雷达23b-2*,*放射性23c-1*、和*放射性23d-1*突变体。使用图5A所示的引物对从野生型和突变型幼苗中分离的总RNA进行RT-PCR。特定于*PAE2型*被用作内部控制。**（B）**1周龄野生型总RNA的RNA凝胶印迹分析，*雷达23*突变体，以及*35S-RAD23b型*使用探针的幼苗*雷达23a*,*RAD23b型*,*RAD23c型*、和*RAD23d型*.用探针检测证实印迹的负载相等*β-微管蛋白4*(管4).（C）野生型粗提物的免疫印迹分析，*雷达23*突变体，以及*35S-RAD23b型*带有RAD23b抗体的幼苗。显示了四种RAD23亚型的SDS-PAGE迁移位置。用抗PBA1抗体进行检测，确认蛋白质负荷相等。

**图7。**
的表型分析*拟南芥* *雷达23b*突变体。**（A）** *放射性23b*突变体改变了叶片的叶序。野生型和单纯合子*雷达23*突变体幼苗在LD中生长7天（顶部）或14天（底部）。**（B）**纯合子*雷达23b-1*根系生长较慢，侧根较少。幼苗在LD条件下在垂直硬质平板上生长1周。**（C）** *放射性23b*植物是半不育的。图为自受精野生型和纯合型西力克*雷达23b-1*植物。白色箭头表示胚珠败育。**（D）**到**（F）**拯救*放射性23b*具有a的表型*35S-RAD23b型*转基因。**（D）**a的基因分型*雷达23b-1*互补线。DNA是从野生型中分离出来的，*雷达23b-1*、和*35S-RAD23b雷达23b-1*幼苗和用特异引物扩增的PCRRAD23b型，T-DNA雷达23b-1，或*35S-RAD23b型*转基因。**（E）**用抗RAD23b抗体进行的免疫印迹分析显示*35S-RAD23b雷达23b-1*幼苗。用抗PBA1抗体进行检测，确认蛋白质负荷相等。**（F）**表型抢救*雷达23b-1*突变体。图中是14天的老植株，显示了一个*35秒*-*RAD23b雷达23b-1*行。

**图8。**
接触MMC会导致*放射性23b*野生型和野生型的叶状体缺陷*放射性23a*,*c（c）*、和d日幼苗。**（A）**在没有或存在5μg/mL MMC的情况下，在LD下生长两周龄幼苗。**（B）**新鲜重量（±标准偏差)在MMC浓度增加的情况下生长的幼苗，并在没有MMC的情况下正常生长。每行分析的幼苗数量为25株（野生型），21株(*雷达23a-1*), 17 (*雷达23b-1*), 20 (*雷达23b-2*)，20(*放射性23c-1*)、和20(*放射性23d-1*).

**图9。**
这个*雷达23b-1*突变体与*转速10-1*突变体。**（A）**到**（E）**的表型*拟南芥*纯合植物*转速10-1*杂合子*雷达23b-1*在短日照周期（8h光/16h暗）下生长。钢筋=2 mm。**（A）**十岁的植物，花序梗上的莲座丛紊乱，花序分枝减少，次生莲座丛（箭头）。**（B）**六周龄的莲座丛，在腋生分生组织处或其附近出现不寻常的针状器官。插图：2周龄幼苗展示*转速10-1*表型（Smalle等人，2003年）。**（C）**花序终止于针状结构。**（D）**在花序茎上腋生分生组织处或其附近出现针状结构。**（E）**毛状体一种针状结构（箭头），由毛状体覆盖，毛状体从中脉的背面出现。**（F）**和**（G）**双纯合的两周龄幼苗表型*rpn10-1雷达23b-1*植物。**（F）**纯合子*转速10-1*幼苗。**（G）**纯合子*雷达23b-1*幼苗。**（H）**双纯合子*rpn10-1雷达23b-1*幼苗。

**图10。**
组合的表型和生化描述*雷达23*突变体。**（A）**两周龄幼苗在LD下生长。**（B）**开花植物在LD下生长8周。**（C）**和**（D）**用抗RAD23b抗体对2周龄幼苗制备的粗提取物进行免疫印迹分析。RAD23a-d亚型的迁移位置如右图所示。箭头在**（D）**标记假定rad23a-1截断的位置。包括用抗PBA1抗体进行的免疫印迹分析，以验证相同的负载。

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