Mitochondrial DNA toxicity in forebrain neurons causes apoptosis, neurodegeneration, and impaired behavior

doi:10.1128/MCB.01149-09

.2010年3月；30(6):1357-67.

doi:10.1128/MCB.01149-09。 Epub 2010年1月11日。

前脑神经元线粒体DNA毒性导致细胞凋亡、神经变性和行为受损

Knut H Lauritzen公司¹, 奥尔夫·莫德斯塔德, 拉尔斯·艾德, 哈拉尔德·卡尔森, 戈特·内塞, 约翰·F·斯托姆, 伊莎贝尔·M·曼西, 琳达·H·伯格森, 阿恩·克伦格兰

附属公司

PMID： 20065039
预防性维修识别码：项目经理2832488
内政部： 10.1128/MCB.01149-09

前脑神经元线粒体DNA毒性导致细胞凋亡、神经变性和行为受损

Knut H Lauritzen公司等。分子细胞生物学. 2010年3月.

.2010年3月；30(6):1357-67.

doi:10.1128/MCB.01149-09。 Epub 2010年1月11日。

作者

Knut H Lauritzen公司¹, 奥尔夫·莫德斯塔德, 拉尔斯·艾德, 哈拉尔德·卡尔森, 戈特·内塞, 约翰·F·斯托姆, 伊莎贝尔·曼苏伊, 琳达·H·伯格森, 阿恩·克伦格兰

附属

¹挪威奥斯陆大学医院和奥斯陆大学医学微生物学研究所分子生物学和神经科学中心，NO-0027奥斯陆。

PMID： 20065039
预防性维修识别码：项目经理2832488
内政部： 10.1128/MCB.01149-09

摘要

神经退行性疾病变化背后的线粒体功能障碍通常与细胞凋亡和神经元的进行性丢失有关，线粒体基因组的损伤被认为与此类病理有关。在本研究中，我们设计了一个小鼠模型，该模型允许我们在成年小鼠的前脑神经元中特异性诱导线粒体DNA毒性。这是通过CaMKIIalpha调节线粒体UNG DNA修复酶（mutUNG1）突变版本的诱导表达实现的。这种酶能够从线粒体基因组中去除胸腺嘧啶。我们证明无嘧啶位点的持续产生会导致细胞凋亡和神经元死亡。这些缺陷与以运动活动增加、认知能力受损和缺乏焦虑样反应为特征的行为改变有关。总之，虽然线粒体碱基替换和缺失之前已被证明分别与过早衰老和自然衰老相关，但我们表明，高水平的无嘧啶位点导致线粒体DNA细胞毒性，导致细胞凋亡，继而导致神经退化。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
CaMKIIα诱导mutUNG1小鼠模型的验证。（a） mutUNG1诱导小鼠的构建设计。（b）转基因小鼠的工作模型。（c） Western分析显示稳定转染细胞中UNG1表达增加。抗线粒体复合物II的抗体用作负荷控制。（d）用电荷耦合装置相机测量转基因创始人小鼠的荧光素酶活性。生物发光表示为光子/s cm²斯特拉迪安。（e）使用琼脂糖凝胶上显示的逆转录酶PCR分析mutUNG1转基因的表达。Cb，小脑；髋，海马；Cpu，尾状壳核。（f）野生型（黑色）和mutUNG1表达小鼠（红色）的存活率。

**图2。**
转基因小鼠中mutUNG1表达的活性和结果。（a）使用5′末端放射性标记的31-mer寡核苷酸测量尿嘧啶和胸腺嘧啶的清除活性，该寡核苷酸包含单个尿嘧啶或单个胸腺嘧啶残基，位于底物5′末端的16位，并与互补链杂交。与组织提取物孵育后，用NaOH裂解产生的中间AP位点并通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行加热和链分离后，从切割的胸腺嘧啶或尿嘧啶残基的量中分析酶活性。使用台风9410和ImageQuant TL v2003.02软件（Amersham/GE Healthcare）对带状物进行可视化和量化。（b） mutUNG1小鼠诱导脑区的尿嘧啶清除活性最高。（c）胸腺嘧啶清除活性仅存在于mutUNG1小鼠的诱导脑区。*，未发现任何活动。（d）血氧饱和度测量表明，与野生型同窝小鼠相比，mutUNG1表达小鼠海马复合体I的线粒体呼吸能力降低。（e） Oxygraph测量结果表明，与野生型同窝出生的小鼠相比，表达mutUNG1的小鼠海马中复合物II的线粒体呼吸能力降低。Cb，小脑；髋，海马；Cpu，尾状壳核。

**图3。**
在表达mutUNG1的小鼠中出现AP位点。（a）用醛反应性探针探测并用DAPI染色的海马和小脑的冠状冷冻切片显示出高水平的AP位点，但仅在诱导的mutUNG1小鼠的海马中。比例尺，100μm。（b） AP位点仅见于海马体中含有线粒体的部分区域，而非细胞核，如图中诱导3个月的mutUNG1小鼠所示。比例尺，25μm。

**图4。**
诱导的mutUNG1小鼠海马区出现进行性萎缩、神经元丢失和凋亡。（a）野生型和mutUNG1表达小鼠在不同诱导时间点的海马HE染色冠状石蜡切片显示，诱导mutUNG2小鼠出现进行性萎缩。（b）海马和尾状壳核的免疫染色冠状冰冻切片与神经元标记物MAP2和星形胶质细胞标记物GFAP的抗体孵育以及DAPI染色显示诱导mutUNG1小鼠海马中的神经元丢失。（c）在不同诱导时间点对野生型和mutUNG1表达小鼠的冰冻切片进行TUNEL（和DAPI）染色显示，诱导mutUNG2小鼠的海马中有高度的凋亡，但尾壳核中没有。比例尺，100μm。

**图5：。**
mutUNG1表达的CA1锥体细胞树突棘上的神经变性和突触后密度膜长度缩短。电子显微照片显示野生型和mutUNG1表达小鼠海马CA1放射层（a）和小脑分子层（b）中末端与树突棘形成不对称（即兴奋性）突触的示例。请注意，在mutUNG1表达的海马体中，组织轮廓较小，包括一段短的PSD（箭头）。显示了以下结构：轴突末端（末端）、突触后棘（脊椎）、PSD末端（箭头）、线粒体（m）、平行纤维Purkinje细胞突触（Pft）和干树突。比例尺，150 nm。（c）直方图显示了海马CA1放射层（c）和小脑分子层（d）中四只mutUNG1表达小鼠和四只野生型同卵鼠兴奋性突触的平均PSD长度±标准偏差。*，所有海马mutUNG1表达小鼠的PSD值均显著低于野生型同窝小鼠(*P（P）*< 0.02).

**图6。**
mutUNG1表达小鼠的运动活动增加，但认知能力和焦虑行为降低。（a）与野生型同窝小鼠相比，表达mutUNG1的小鼠表现出更高的运动活性，表现为在野外测试中行走的总距离。（b）与野生型同窝小鼠相比，表达MutUNG1的小鼠在野外试验中表现出更高的饲养活动。（c）探针试验期间，在水迷宫四个象限中的每个象限中花费的时间百分比。mutUNG1小鼠在目标象限的停留时间少于野生型同窝小鼠。这两项探针试验的结果已经汇总。（d）在第5天的探测试验中，水迷宫中有代表性的游泳路径。（e）两个探针试验在水迷宫的目标象限中花费的时间百分比。（f）水迷宫测试期间触觉趋同的时间百分比（即啮齿动物拥抱墙壁的趋势）。（g）在水迷宫任务的学习阶段定位平台位置的延迟。（h）进入高架零迷宫的开放区域。诱导的mutUNG1小鼠进入开放区域的频率越高，焦虑反应越少。（i）高架零迷宫开放区域的时间百分比。诱导的mutUNG1小鼠通过在开放区域花费更多时间来减少焦虑反应。（j）高架零迷宫任务中头部的代表路径。闭合象限用双线标记。

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