IRE1alpha controls cyclin A1 expression and promotes cell proliferation through XBP-1

doi:10.1007/s12192-009-0163-4

.2010年9月；15(5):497-508.

doi:10.1007/s12192-009-0163-4。 Epub 2009年12月15日。

IRE1alpha通过XBP-1控制细胞周期蛋白A1的表达并促进细胞增殖

杰弗瑞·A·索普¹, 史蒂文·施瓦兹

附属公司

PMID： 20013084
预防性维修识别码： PMC3006623型
内政部： 2007年10月17日/12192-009-0163-4

IRE1alpha通过XBP-1控制细胞周期蛋白A1的表达并促进细胞增殖

杰弗瑞·A·索普等人。细胞应激伴侣. 2010年9月.

.2010年9月；15(5):497-508.

doi:10.1007/s12192-009-0163-4。 Epub 2009年12月15日。

作者

杰弗瑞·A·索普¹, 史蒂文·施瓦兹

附属

¹肯塔基大学马基癌症中心和分子与细胞生物化学系，美国肯塔基州列克星敦市玫瑰街800号307库姆斯大楼，邮编40536。

PMID： 20013084
预防性维修识别码： PMC3006623型
内政部： 2007年10月17日/12192-009-0163-4

摘要

IRE1是一种保守的双内核糖核酸酶/蛋白激酶，对于指导酵母、苍蝇和蠕虫的内质网应激反应必不可少。然而，在哺乳动物系统中，IRE1α进行的精确生物活性尚不清楚。在这里，分子和化学遗传学方法被用于控制一些前列腺癌细胞系中IRE1的活性，并对其对基因转录、细胞存活和增殖的影响进行了研究。调节IRE1α活性对与内质网应激反应（Grp78和CHOP）或细胞生存相关的基因的诱导没有转录作用。相反，IRE1α活性与增殖呈正相关。由于Xbp-1 mRNA是IRE1内核糖核酸酶活性的唯一已知底物，因此研究了该转录因子在介导增殖中的作用。通过siRNA技术抑制总Xbp-1水平有效减缓了增殖。为了确定负责细胞周期反应的IRE1/XBP-1靶点，进行了全基因组差异mRNA表达分析。IRE1α诱导与感受内质网应激的能力一致，导致内质网高尔基体、质膜和分泌基因产物的富集。细胞周期蛋白A1表达增加是发现的唯一差异表达的细胞周期调控基因。在IRE1α活性的细胞中持续观察到较高的细胞周期蛋白A蛋白水平，并且依赖于XBP-1。我们得出结论，IRE1α活性控制内质网应激反应的一个子集，并通过严格控制Xbp-1剪接介导增殖。

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数字

图1
人前列腺上皮细胞内质网应激反应的诱导。一将DU145、LNCaP和PC-3细胞暴露于MG132（1µM）或衣霉素（2µg/ml）或thapsigargin（300 nM）中24 h，并进行Western blot分析以检测GRP78和ß-actin。b条细胞株暴露于thapsigargin（300 nM）或指示浓度的Velcade 24小时。分离总RNA，并通过RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳检测cDNA，以识别*Xbp-1型*拼接状态。u个未分割，秒拼接的

图2
IRE1活性的降低减缓了细胞增殖。一对稳定表达激酶缺陷型IRE1（K599A）或对照pBabe-puro（puro）载体的PC-3细胞进行蛋白质印迹分析。b条将表达PC-3 puro和K599A IRE1的细胞暴露于衣霉素（2µg/ml）和thapsigargin（300 nM）24小时。分析细胞的非分裂丰度(u个)和拼接(秒)*Xbp-1型*.cCHOP公司和*组78*在PC-3细胞中测定mRNA表达b条在标准化到亲环素B或18S rRNA后，通过qPCR进行。18S标准化仅用于thapsigargin（Tg），因为该处理诱导了亲环素B。显示了三个实验的平均值±标准偏差。d日PC-3细胞（Puro和K599A IRE1）用指定浓度的thapsigargin处理24小时(左边)、Velcade(*中间的*)，或TRAIL(*正确的*)用MTT比色法测定存活率。**e（电子）**在PC-3上进行BrdU标记(左边)和LNCaP(*正确的*)仅表达K599A IRE1结构或载体的细胞（Puro）。显示了三个重复的平均值±标准偏差**P（P）* = 0.002; ***P（P）* = 0.01

图3
IRE1 I642G赋予内核糖核酸酶活性并诱导增殖。一(顶部)对稳定表达I642G IRE1结构的对照（Puro）和PC-3细胞进行Western blot分析以检测IRE1的表达。(底部)用DMSO、1NM-PP1（5µM）或thapsigargin（Tg，300 nM）处理稳定表达I642G IRE1结构的对照（Puro）和PC-3细胞24小时，并*Xbp-1型*检查拼接。b条在存在或不存在1NM-PP1（5µM）的情况下，用Velcade和thapsigargin处理PC-3细胞（Puro和IRE1-I642G）24 h，并用MTT分析量化细胞活力。数值表示平均值±标准偏差。c的表达式*CHOP公司*和*组78*通过实时定量PCR测定用DMSO或1NM-PP1（5µM）处理24小时的PC-3细胞（Puro和IRE1-I642G）中的mRNA。将数值标准化，并与仅用二甲基亚砜处理的Puro细胞进行比较。*误差线*反映标准偏差。d日(顶部)对稳定表达I642G IRE1结构的对照（Puro）和DU145细胞进行Western blot分析以检测IRE1的表达。(底部)将稳定表达I642G IRE1的Puro和DU145细胞用DMSO、1NM-PP1（5µM）或thapsigargin（Tg，300 nM）处理24小时*Xbp-1型*检查拼接。(**e（电子）**)处理DU145细胞（Puro和I642G IRE1），结果如所述b条.（f）在PC-3上进行BrdU标记(左边)和DU145(*正确的*)仅表达I642G IRE1结构或载体的细胞（Puro）。将1NM-PP1（5µM）添加到PC-3细胞中24小时。在没有1NM-PP1的情况下，根据血清浓度对DU145细胞进行BrdU标记。显示了三个重复的平均值±标准偏差。克*Xbp-1型*稳定表达IRE1 K599A或I642G或空pBabe Puro结构的PC-3细胞的剪接状态。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCR反应。注意，减少了*新加坡先令*-K599A细胞中的1个水平和剪接的诱导*Xbp-1型*与Puro控件相比，I642单元格中的消息

图4
野生型IRE1过度表达对Xbp-1剪接和增殖的影响。一对稳定表达所示结构的三个细胞系进行Western blot分析，以检测IRE1和ß-actin的表达。用1NM-PP1（5µM）、Velcade（100 nM）或thapsigargin（Tg，300 nM）处理细胞24小时。b条通过Western blot分析检测稳定表达野生型IRE1的DU145细胞，以确认蛋白过度表达。c将过度表达野生型IRE1的DU145细胞暴露于Velcade 24小时*Xbp-1型*琼脂糖凝胶电泳揭示剪接状态(左边)并通过NIH ImageJ软件进行量化(*正确的*).d日对过度表达野生型IRE1的DU145细胞和Puro对照细胞进行BrdU掺入分析。数值反映平均值±标准偏差。**e（电子）**产生稳定过度表达野生型IRE1的PC-3细胞，并通过Western blot分析蛋白质过度表达。**（f）**过度表达IRE1结构的PC-3细胞和对照细胞暴露于Velcade 4 hXbp-1型琼脂糖凝胶电泳揭示剪接状态(左边)并通过NIH ImageJ软件进行量化(*正确的*).克对对照PC-3细胞（Puro）和过度表达野生型IRE1的细胞进行BrdU掺入分析。数值反映平均值±标准偏差

图5
剪接XBP-1对细胞增殖的调节。一百分比*Xbp-1型*与非靶向对照组相比，在DU145细胞中siRNA介导的敲除后的mRNA表达。b条用siRNA转染DU145细胞以靶向*Xbp-1型*或加扰控制。48小时后，通过BrdU标记对细胞进行分析。数值反映平均值±标准偏差**P（P）* = 0.0002, ***P（P）* = 0.0003

图6
的标识*细胞周期蛋白A1*作为IRE1/XBP-1依赖基因。一基因本体论证明了IRE1 I642G PC-3细胞与IRE1野生型细胞中差异表达的基因的定位。b条定量PCR评估*细胞周期蛋白A1*基因表达(左边)I642G IRE1 PC-3细胞与野生型IRE1和(*中间的*)与DMSO处理的细胞相比，thapsigargin处理后的PC-3细胞中。*误差线*反映折叠变化±标准偏差。(*正确的*)用PCR方法评估thapsigargin处理细胞的Xbp-1剪接状态。c如图所示，在存在或不存在1NM-PP1的情况下，通过Western blot分析测定野生型和I642G IRE1 PC-3细胞中的细胞周期蛋白A蛋白表达。这个数字反映了与野生型IRE1相比，cyclin A表达的折叠变化。d日在缺乏1NM-PP1的情况下，通过Western blot分析测定野生型、K599A和I642G IRE1 PC-3细胞中的细胞周期蛋白A蛋白表达。这个数字反映了与野生型IRE1相比，cyclin A表达的折叠变化。**e（电子）**用扰乱阴性（SN）或XBP-1 siRNA转染表达I642G IRE1的DU145细胞和Puro对照细胞48小时，并通过蛋白质印迹分析检测细胞周期蛋白a的表达。这个数字反映了细胞周期蛋白A表达与SN转染的PC-3 puro细胞相比的倍数变化

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