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.2010年2月；30(4):908-21.
doi:10.1128/MCB.00601-09。 Epub 2009年12月7日。

mTORC1激活的S6K1磷酸化苏氨酸1135上的Rictor并调节mTORC2信号

路易斯·安德烈·朱利安 1, 奥黛丽·卡里尔, 朱丽·莫罗, 菲利普·P·鲁
附属公司

mTORC1激活的S6K1磷酸化苏氨酸1135上的Rictor并调节mTORC2信号

路易斯·安德烈·朱利安等。 分子细胞生物学. 2010年2月.

摘要

雷帕霉素（mTOR）的哺乳动物靶点是一种保守的Ser/Thr激酶，它形成两种功能不同的复合物，对营养素和生长因子的信号传递至关重要。虽然mTOR复合物1（mTORC1）调节mRNA翻译和核糖体生物生成，但mTORC2在Akt的磷酸化和随后的活化中起着重要作用。有趣的是，mTORC1负性调节Akt激活，但mTORC1-信号是否直接靶向mTORC2尚不清楚。在这里，我们表明生长因子促进了mTORC2的基本亚单位Rictor（mTOR的雷帕霉素敏感性伴侣）的磷酸化。我们发现Rictor磷酸化需要mTORC1活性，更具体地说，需要p70核糖体S6激酶1（S6K1）。我们在Rictor中鉴定了几个磷酸化位点，发现在体外和体内，S6K1以雷帕霉素敏感的方式直接磷酸化了Thr1135。Thr1135上Rictor的磷酸化并不影响mTORC2组装、激酶活性或细胞定位。然而，发现表达Rictor T1135A突变的细胞增加了mTORC2依赖的Akt磷酸化。此外，发现这些细胞中Akt底物FoxO1/3a和糖原合成酶激酶3α/β（GSK3α/贝塔）的磷酸化增加，表明S6K1介导的Rictor磷酸化抑制mTORC2和Akt信号。总之，我们的结果揭示了两个mTOR复合物之间的一种新的调控联系，其中Rictor整合了mTORC1依赖性信号。

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数字

图1。
图1。
识别作为mTORC1信号靶点的Rictor。（A） 本研究中使用的激动剂和药物抑制剂的示意图。（B） 用空载体或HA标记的Rictor转染HEK293细胞；血清饥饿过夜；用PMA（50 ng/ml）、胰岛素（100 nM）、EGF（50 ng/ml）或胎牛血清（10%）刺激10或20分钟。然后用识别RXRXXpS/T共有基序的磷酸化抗体对免疫沉淀（IP）Rictor进行磷酸化分析。（C和D）对于B组，除了细胞在PMA或胰岛素刺激前用U0126（20μM）、雷帕霉素（100 nM）或沃特曼（100 nM）预处理30分钟外。（E和F）从HEK293（E）或HeLa（F）细胞中免疫沉淀内源性Rictor，并对B组进行分析。
图2。
图2。
S6K1是细胞中Rictor磷酸化所必需的。（A） HEK293细胞与HA-标记的Rictor和siRNA双链体共同转染，靶向扰乱序列（Scr）或人类S6K1。将细胞血清饥饿过夜，并用PMA（50 ng/ml）或胰岛素（100 nM）刺激20分钟。然后用抗RXRXXpS/T抗体分析免疫沉淀Rictor的磷酸化。（B） 稳定表达靶向干扰序列（Scr）或S6K1的shRNA的HEK293细胞被HA-标记的Rictor转染，血清饥饿过夜，并在胰岛素（100 nM）刺激20分钟之前用雷帕霉素（100 nS）处理30分钟。免疫沉淀的Rictor按a组进行分析。
图3。
图3。
S6K1足以促进细胞中的Rictor磷酸化。（A） 本研究中使用的S6K1结构的示意图。组分激活的S6K1（CA）由F5A、T389E和R410/413/414A（R3A）突变组成。S6K1（KD）的激酶激活等位基因由激酶结构域II亚域中的K100R突变组成。（B） 用myc标记的Rictor和表达HA标记的野生型（wt）、组成性激活（CA）或激酶激活（KD）S6K1的构建物共同转染HEK293细胞。将细胞血清饥饿过夜，并在收获前用胰岛素（100nM）处理20分钟。在抗myc免疫沉淀物中检测Rictor的磷酸化。（C和D）对于B组，除S6K1 CA和Rheb表达细胞外，在收获前用雷帕霉素（100 nM）预处理30 min。
图4。
图4。
鉴定Thr1135为Rictor中雷帕霉素敏感的磷酸化位点。（A） 已知S6K1底物中的磷酸化位点符合K/RXRXXpS/T共识。Rictor含有四个符合这一共识的残基，分别对应于Ser21、Ser1113、Thr1135和Ser1219。（B） 对来自HEK293细胞的免疫沉淀内源性和外源性Rictor进行MS/MS分析，发现13个磷酸化位点，其中三个位于K/RXRXXpS/T共识基序内（Ser21、Thr1135和Ser1219）。白色区域表示Rictor直系图之间的最高保守性区域。（C） 用野生型Rictor或潜在S6K1磷酸化位点突变体S21A、S1113A、T1135A和S1219A转染HEK293细胞；血清饥饿过夜；并用胰岛素（100 nM）刺激20分钟。免疫沉淀Rictor随后在RXRXXpS/T位点进行免疫印迹磷酸化。（D） 前体的串联质谱米/z825.03+，对应于小鼠Rictor的磷酸肽TL（pT）EPSVDLNHSEDFTSSSAQK。（E） 对于C组，除了用PMA（50 ng/ml）刺激细胞，并通过免疫印迹法检测Rictor磷酸化。用野生型Rictor和野生型Rheb（F）或组分活化的S6K1（G）转染（F和G）HEK293细胞。隔夜将细胞血清饥饿，免疫沉淀的Rictor在RXRXXpS/T位点进行免疫印迹磷酸化。
图5：。
图5：。
使用一种新型磷酸化特异性抗体检测Thr1135的Rictor磷酸化。（A） 一级序列比对显示不同脊椎动物物种Rictor中Thr1135以及−3和−5碱基残基的保存。（B） 产生了一种针对Thr1135的磷酸特异性抗体，并在免疫沉淀Rictor上进行了测试。用野生型Rictor或磷酸化位点突变体转染HEK293细胞，将血清饥饿过夜并用胰岛素（100 nM）刺激20分钟。使用磷酸化-Thr1135抗体检测Rictor免疫沉淀物。（C） 用野生型Rictor和Rheb转染HEK293细胞，将血清饥饿过夜，并用雷帕霉素（20 nM）处理30分钟。使用磷酸化-T1135抗体检测Rictor磷酸化。（D） TSC2系统+/+或TCS2−/−在无血清的情况下培养MEF，并用雷帕霉素（100 nM）处理30分钟。使用磷酸化-Thr1135抗体检测内源性Rictor的磷酸化。（E） 稳定表达HA标记野生型Rictor的HEK293细胞转染组分活化Akt（Myr-Akt）或组分活化S6K1（S6K-CA）。细胞隔夜血清饥饿，用雷帕霉素（100 nM）处理，并在需要的地方用胰岛素（100 nM）刺激。使用磷酸化-T1135抗体检测Rictor磷酸化。
图6。
图6。
S6K1磷酸化Thr1135上的Rictor在体外（A）S6K1从用胰岛素（100nM）刺激的HEK293细胞中免疫沉淀，并在与[γ-32P] ATP与含有野生型和T1135A序列的GST-Rictor融合蛋白。（B） 对于A组，除了细胞在S6K1免疫沉淀前用雷帕霉素（100 nM）预处理30 min，并用胰岛素或PMA刺激20 min。（C） 来自胰岛素刺激细胞的免疫沉淀野生型或激酶激活型S6K1与免疫纯化全长野生型或T1135A Rictor在无放射性的激酶反应中孵育。对所得样品进行SDS-PAGE和免疫印迹，以在RXRXXpS/T共识位点上进行Rictor磷酸化。
图7。
图7。
不能在Thr1135上磷酸化的Rictor突变体促进mTORC2定向的Akt磷酸化。（A） 用针对扰乱序列或人类猛禽的siRNA双链转染HEK293细胞。细胞在血清中生长，或隔夜饥饿血清，并用EGF（25 ng/ml）或胰岛素（100 nM）刺激。通过使用Akt磷酸化-Ser473抗体从细胞裂解液中进行免疫印迹来检测Akt的磷酸化。（B） HEK293细胞在用胰岛素（25 nM）（左面板）或EGF（25 ng/ml）（右面板）刺激之前，将其血清饥饿过夜，并用雷帕霉素处理30分钟。对面板A DMSO二甲基亚砜的Akt磷酸化进行了分析。（C） 稳定表达空载体Rictor野生型Rictor或T1135A或T1135D突变体的HEK293细胞以类似密度接种，并将血清饥饿过夜。用EGF（25 ng/ml）刺激细胞5或10 min，并使用NDRG1磷酸化-Thr346/Thr356/Thr366抗体检测Akt和NDRG1的磷酸化。（D和E）对C组的三个独立实验的结果进行量化，并计算Akt（D）和NDRG1（E）磷酸化的平均（±SD）倍刺激，与空载体对照进行比较。（F） 靶向扰乱序列或人类Rictor的siRNA双链转染HEK293细胞，稳定表达空载体或siRNA耐药野生型Rictor或T1135A或T1135D突变体。将细胞在血清中饥饿过夜，用EGF（25 ng/ml）刺激，然后采集细胞进行血清473磷酸化的FACS分析（详见材料和方法）。在HA-Rictor阳性细胞中测定磷酸化Akt的水平。与未刺激的空载体转染细胞相比，数据表示为Akt磷酸化的折叠刺激。
图8。
图8。
Thr1135的Rictor磷酸化抑制Akt信号传导和细胞增殖。（A） 用标记的mTOR和野生型HA-标记的Rictor或Thr1135突变体转染HEK293细胞。使用抗Flag抗体在抗HA免疫沉淀物中测定相关的mTOR。（B） mTORC2激酶分析通过免疫沉淀HEK293细胞的内源性Rictor来优化，该细胞由EGF刺激（25 ng/ml），并在指定位置用双重PI3K/mTOR抑制剂PI-103处理（左面板）。使用这些分析条件，在未刺激或EGF刺激的细胞（右侧面板）中的HA标记的Rictor野生型或突变免疫沉淀物中测量mTORC2活性。对从哺乳动物细胞纯化的激酶活性GST-Akt的mTORC2活性进行了测定。（C） 野生型Rictor和Rictor Thr1135突变体的亚细胞定位。显示了稳定表达HA标记野生型Rictor或Thr1135突变体的血清生长HEK293细胞的共焦图像。（D） 将稳定表达野生型Rictor或Thr1135突变体的HEK293细胞进行血清饥饿过夜，并用EGF（25 ng/ml）刺激。通过免疫印迹法检测Akt底物FoxO1/3a和GSK3α/β的磷酸化。（E） 在含有5%FBS的培养基中培养稳定表达野生型Rictor或Thr1135突变体的HEK293细胞。使用MTS测定法连续五天测量活细胞的相对数量。（F） 生长因子刺激后，PI3K通过IRS依赖性和非依赖性机制被募集到质膜。PIP3介导的Akt向质膜的募集分别促进了Thr308和Ser473处的PDK1和mTORC2依赖性Akt磷酸化。激活后，Akt磷酸化TSC2，释放TSC复合物对Rheb的抑制功能。然后，负载GTP的Rheb激活mTORC1，后者磷酸化并激活S6K1。活化的S6K1磷酸化多种底物，包括IRS-1和Rictor，它们在mTORC2信号的负调控中发挥作用。
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