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.2010年2月；21(2):249-60.
doi:10.1681/ASN.2009010018。 Epub 2009年12月3日。

晚期糖基化终产物通过TGF-β非依赖性Smad3信号传导诱导管状CTGF

亚瑟·C·K·钟 1, 张海燕, Yao-Zhong（香港）, 佳居滩, 肖尔·黄, 杰弗里·B·科普, 许玉兰
附属公司

晚期糖基化终产物通过TGF-β非依赖性Smad3信号传导诱导管状CTGF

亚瑟·C·K·钟等。 J Am Soc肾病. 2010年2月.

摘要

晚期糖基化终产物（AGEs）可诱导结缔组织生长因子（CTGF）的表达，似乎可以促进糖尿病肾病的发展，但介导这种诱导的确切信号机制尚不清楚。在这里，AGEs诱导缺乏TGF-beta1基因或表达显性TGF-beta受体II的肾小管上皮细胞（TEC）中CTGF表达，表明TGF-be塔的独立性。此外，肾脏中TGF-β受体II编码基因的条件性敲除并不能阻止AGE诱导的CTGF和I型胶原在肾脏的表达。更具体地说，AGEs通过AGEs-细胞外信号调节激酶（RAGE-ERK）受体诱导CTGF的表达/p38有丝分裂原激活蛋白激酶-Smad串扰通路，因为几种方法（抗RAGE抗体、特异性抑制剂或ERK1/2和p38的显性阴性腺病毒）抑制了该通路，从而阻断了这种诱导。过度表达Smad7可消除AGE诱导的Smad3磷酸化和CTGF表达，这表明Smad信号在这一过程中激活的必要性。更重要的是，Smad3或Smad2的敲除证明Smad3而非Smad2对AGEs诱导CTGF至关重要。总之，AGEs通过TGF-β非依赖性RAGE-ERK/p38-Smad3串扰途径诱导肾小管CTGF表达。这些数据表明Smad7的过度表达或靶向Smad3可能对糖尿病肾病有治疗潜力。

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数字

图1。
图1。
AGEs以时间和剂量依赖的方式诱导NRK52E细胞中CTGF的表达。（A） 实时PCR显示，AGEs（33μg/ml）而非BSA以时间依赖性方式诱导CTGF mRNA表达，在6小时时显著以时间依赖性的方式诱导CTGF表达，在12小时时显著，在24至48小时内达到峰值。AGEs诱导的CTGF的表达受到中和RAGE抗体（抗RAGE）的抑制，但不受对照兔IgG抗体（Rb-IgG）的抑制。（D） Western blot表明，AGEs以剂量依赖的方式诱导CTGF蛋白表达，峰值为33和66μg/ml，这被中和抗RAGE抗体（10μg/ml）抑制，但不被同型对照Rb-IgG抑制。BSA在所有实验中起控制作用。每个条形代表至少三个独立实验的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01***P（P）< 0.001与BSA对照或时间0（或剂量0）##P（P）< 0.01, ###P（P）< 0.001与对照抗体如图所示。
图2。
图2。
AGEs诱导管状CTGF表达通过TGF-β1 KO-TEC中TGF-α非依赖性Smad信号通路。（A和B）实时PCR（A）和Western blot分析（B）表明，AGEs（33μg/ml）而非BSA对照（33μg/ml）能够诱导TGF-β1 WT和KO-TEC中CTGF mRNA（6小时）和蛋白质表达（24小时）。（C） Western blot表明，AGEs（33μg/ml）而非对照BSA（33μg/ml）诱导WT TEC中Smad3的磷酸化，有两个峰值（15至30分钟和18至24小时），而AGE刺激后TGF-βKO TEC仅检测到早期Smad3磷酸化（15至30min）。每个条形代表至少三个独立实验的平均值±SEM***P（P）< 0.001与时间0和BSA控制。
图3。
图3。
AGEs诱导管状CTGF表达通过显性阴性TβRII过度表达的NRK52E细胞系中TGF-β非依赖性Smad信号通路。（A） RT-PCR显示显性阴性TβRII mRNA在转染显性阴性TαRII的两个NRK52E细胞系中稳定表达，但在正常NRK52E细胞中不表达。P、 显性阴性TβRII载体的PCR阳性控制；N、 无表达载体的PCR阴性对照。（B） 实时PCR分析表明，AGEs（33μg/ml）而非BSA对照（33μg/ml）能够诱导正常NRK52E细胞和显性阴性TβRII过度表达的NRK52E细胞中CTGF mRNA的表达（在6小时时）。（C） Western blot分析表明，AGEs（33μg/ml）而非BSA对照组（33μg/ml）能够诱导正常NRK52E细胞和显性阴性TβRII过度表达的NRK52E细胞中CTGF蛋白表达（24小时）。注意，添加TGF-β1（2.5 ng/ml）能够诱导正常NRK52E中CTGF的表达，但在过度表达显性阴性TβRII的NRK52E-细胞中不存在。（D） Western blot表明，AGEs（33μg/ml）而非对照BSA（33μg/ml）诱导正常NRK52E中Smad3的磷酸化，有两个峰值（15至30分钟和18至24小时），而在AGE刺激后显性阴性TβRII过度表达的NRK52E细胞中仅检测到早期Smad3磷酸化（15至30min）。注意，TGF-β1诱导的Smad2/3（推测为Smad3）磷酸化（2.5 ng/ml）存在于正常NRK52E中，但在过度表达显性阴性TβRII的NRK52E细胞中不存在。每个条形代表至少三个独立实验的平均值±SEM**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001与时间0和BSA控制###P（P）< 0.001与AGE处理的TEC。
图4。
图4。
免疫组织化学法研究TβRII条件性缺失对AGE输注小鼠模型中AGE诱导的肾脏CTGF和I型胶原表达的影响。（A） PCR显示，与删除的等位基因（692 bp）相比，超声介导的Cre-rewise质粒（255 bp）能够从肾脏中删除约70%的漂浮TβRII（575 bp）。（B） 免疫组织化学显示，超声介导的Cre/lox重组导致肾小球和肾小管间质中肾细胞的TβRII大量缺失。（C） 免疫组织化学显示，与单独使用BSA、单独使用超声微泡和BSA+超声+控制质粒相比，AGE输注能够上调肾脏CTGF和I型胶原的表达。超声介导的肾脏Cre/lox重组导致肾脏TβRII基因缺失，不会改变AGE诱导的肾脏CTGF和I型胶原的表达。结果代表三组小鼠。放大倍数，×400。
图5。
图5。
实时PCR和Western blot分析显示TβRII条件缺失对AGE输注小鼠模型中AGE诱导的肾脏CTGF和I型胶原表达的影响。（A和B）实时PCR（A）和Western blot（B）分析表明，虽然超声介导的Cre/lox重组删除了肾脏中TβRII基因的表达，但TβRI基因的删除并不阻止AGE诱导的肾脏CTGF和纤维化标记物的表达，如I型胶原和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA和蛋白的表达。数据代表三只老鼠组成的组。每个条形代表平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01***P（P）< 0.001与正常小鼠#P（P）< 0.05与未经超声治疗的AGE输注小鼠。
图6。
图6。
AGEs诱导ERK1/2和p38 MAPK的早期磷酸化通过TGF-β非依赖性Smad信号通路。（A） ERK1/2磷酸化。（B） p38磷酸化。Western blot表明，AGEs（33μg/ml）但不控制BSA（33μg/ml）诱导TGF-β1 WT TEC中ERK1/2和p38的磷酸化，具有两个峰值（30分钟和18小时）。相反，在TGF-β1 KO-TEC中，AGEs仅诱导ERK1/2和p38的早期磷酸化。数据为至少3个独立实验的平均值±SEM。
图7。
图7。
AGEs诱导Smad3活化通过RAGE介导的ERK/p38 MAPK机制。一个典型的Western blot显示，在30分钟时，AGE诱导的TGF-β1 KO TEC中的Smad3快速磷酸化（33μg/ml）分别被兔中和RAGE抗体（抗RAGE；10μg/ml）和ERK1/2（PD98059；10μM）和p38 MAPK（SB203580；10μM）抑制剂阻断。用显性阴性ERK（Adv-DN-ERK）和p38（Adv-DNA-p38）腺病毒感染细胞进一步证实了这一点。BSA（33μg/ml）、正常兔IgG（Rb-IgG；10μg/ml。每个条形代表至少三个独立实验的平均值±SEM**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001与如图所示进行控制。
图8。
图8。
AGEs诱导CTGF表达通过RAGE介导的ERK/p38 MAPK机制。（A） 实时PCR。（B） 蛋白质印迹分析。结果表明，兔中和RAGE抗体（抗RAGE；10μg/ml）和ERK1/2抑制剂（PD98059；10μM）和p38抑制剂（SB203580；10μM）阻断了AGE诱导的（33μg/ml。当细胞感染显性阴性ERK1/2（Adv-DN-ERK）或p38（Adv-DNA-p38）腺病毒时，也观察到类似的抑制作用。BSA（33μg/ml）、正常兔IgG（Rb-IgG；10μg/ml。每个条代表至少三个独立实验的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001与如图所示进行控制。
图9。
图9。
Smad7的过度表达抑制AGE诱导的、Smad3介导的TEC中CTGF的表达。（A） 典型的Western blot显示，添加Dox（2μg/ml）可在稳定的Dox调节的Flag-M2-Smad7表达的TEC细胞系（NRK52E）中诱导Smad7转基因表达，由抗Flag-M2抗体确定。Dox诱导的Flag-M2-Smad7过度表达在30分钟时阻止AGE诱导的（33μg/ml）Smad3磷酸化，在24小时时阻止CTGF表达。（B）实时PCR分析表明，Dox诱导Smad7的过度表达在6小时时抑制AGE诱导（33μg/ml）CTGF mRNA的表达。每个条代表至少三个独立实验的平均值±SEM**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001与时间0或对照BSA（33μg/ml）处理##P（P）< 0.01, ###P（P）< 0.001与AGE处理的TEC没有Dox。
图10。
图10。
AGE诱导的肾小管CTGF表达依赖于Smad3而非Smad2。（A） 实时PCR分析表明，Smad2或Smad3在单独表达Smad2和Smad3 shRNA的稳定TEC细胞系中被特异性敲除（KD）；然而，敲低Smad3而非Smad2可在6小时时阻断AGE诱导的（33μg/ml）CTGF mRNA表达*P（P）< 0.05与0小时#P（P）< 0.05, ##P（P）< 0.01与WT电池。（B） Western blot分析表明，Smad2或Smad3在单独表达Smad2和Smad3 shRNA的稳定TEC细胞系中被特异性敲除（KD）。Western blot分析还表明，敲除Smad3而非Smad2可在24小时阻断AGE诱导的（33μg/ml）CTGF蛋白表达。每个条代表四个独立实验的平均值±SEM*P（P）< 0.05与牛血清白蛋白（33μg/ml）###P（P）< 0.001与AGE处理的WT细胞。
图11。
图11。
AGE诱导的CTGF表达示意图如图所示。AGEs参与RAGE激活Smad信号通过ERK/p38 MAPK-Smad信号交叉通路（TGF-β独立通路）和经典TGF-α信号通路（TGFβ依赖通路）诱导CTGF表达。
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