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.2009年12月；119(12):3637-51.
doi:10.1172/JCI38308。 Epub 2009年11月16日。

外膜IL-6/MCP1扩增环加速巨噬细胞介导的血管炎症导致小鼠主动脉夹层

布赖恩·C·蒂厄 1, Chang Lee公司, 洪孙, 旺达·勒琼, 阿德里安·雷西诺第三, 小溪居, 海蒂·斯普拉特, 郭东川, 戴安娜·米列维茨, 罗纳德·G·蒂尔顿, Allan R Brasier公司
附属公司

外膜IL-6/MCP1扩增环加速巨噬细胞介导的血管炎症导致小鼠主动脉夹层

布莱恩·蒂厄等。 临床研究杂志. 2009年12月.

摘要

血管炎症可导致主动脉瘤和夹层等心血管疾病。然而，确切的炎症途径尚未明确界定。我们在这里已经证明，将血管升压药Ang II皮下输注到老年C57BL/6J小鼠体内，可以诱导主动脉产生促炎细胞因子IL-6和单核细胞趋化剂MCP-1。这些因子的产生主要发生在外膜，以及巨噬细胞的募集、外膜的扩张和胸主动脉和肾上腺主动脉夹层的形成。相反，将Ang II输注到缺乏IL-6或MCP-1受体CCR2的小鼠后，观察到解剖发生率降低。进一步分析显示，Ang II在主动脉夹层中选择性诱导CCR2+CD14hiCD11bhiF4/80-巨噬细胞聚集，而在Il6-/-小鼠的主动脉中没有。通过将Ccr2+/+单核细胞移植到Ccr2-/-小鼠中，导致ROS应激增强区域的升主动脉和肾上腺主动脉选择性摄取单核细胞，IL-6分泌恢复，剥离发生率增加。体外，单核细胞和主动脉外膜成纤维细胞共培养产生富含MCP-1和IL-6的条件培养液，促进单核细胞分化为巨噬细胞，诱导CD14和CD11b上调，并诱导MCP-1及MMP-9表达。这些结果表明，主动脉外膜中的白细胞-成纤维细胞相互作用增强了IL-6的生成，诱导局部单核细胞的募集和激活，从而促进MCP-1分泌、血管炎症、ECM重塑和主动脉失稳。

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数字

图1
图1。老年WT小鼠输注Ang II可诱导主动脉细胞因子和主动脉瘤剥离。
(A类)肾上腺腹主动脉和胸主动脉夹层的发展；解剖的主动脉被拍到，肾脏向左，心脏向右。(B类)假手术组和Ang II治疗组的照片（上图）以及横截面的Movat染色（下图）。原始放大倍数，×40。放大照片见补充图5。(C类)假手术组主动脉外植体培养中分泌的IL-6和MCP-1浓度(n个=8）或Ang II–10天后注入小鼠(n个=12）对于小于2个月大或7-10个月大的小鼠。顶部面板显示整个主动脉孵育后的测量结果；底部面板显示，外植体培养基中的细胞因子浓度与主动脉干重标准化。数据为平均值±SEM。各组以治疗（Ang II）或年龄为自变量，通过双向方差分析进行比较。对于每次比较P（P）显示年龄效应、Ang II效应以及Ang II与年龄的相互作用效应（AngII*年龄）的值。(D类)假手术组和Ang II治疗组小鼠升主动脉横切面（6μm）中巨噬细胞（MOMA-2）、AoAFs（ERTR7）、IL-6和MCP-1的免疫荧光染色持续6天。细胞核用DAPI（蓝色）染色。介质的弹性薄片为绿色（自荧光）。阳性染色为红色（Alexa Fluor 568–共轭次级抗体）。原始放大倍数，×200。
图2
图2。WT小鼠主动脉巨噬细胞对Ang II的反应表现出不同的表型。
(A类)H&E染色分离主动脉组织的细胞分裂素制备：150μm（左），50μm（右）（原始放大倍数：×200[左]；×400[右]）。(B类)分离的主动脉细胞在CD14上进行门控（左上）；带同型控制的直方图（灰色）显示在左下角。CD14号机组+细胞被分离成CD14+CD11b型+和CD14+CD11b型–细胞。CD11b型+与同种型对照相比，通过直方图确认细胞。CD14号机组+CD11b型+细胞为F4/80+，而CD14+CD11b型–细胞为F4/80–.CD14+CD11b型+80层/四层+对其进行反向分析，以揭示巨噬细胞的数量（右上角的红色轮廓圆圈）。巨噬细胞免疫荧光染色（CD11b+)显示外膜定位。原始放大倍数，×200。(C类)CD14号机组+CD11b型+80层/四层+通过Ang II治疗，WT小鼠假处理主动脉中的巨噬细胞被招募。主动脉夹层中的巨噬细胞数量增加，但缺乏F4/80。(D类)比较假融合主动脉（蓝色曲线）、注入血管紧张素II的主动脉（绿色曲线）和注入血管紧张素II的主动脉夹层（红色曲线）巨噬细胞群CD14、CD11b和F4/80表达的直方图。(E类)Ang II招募CCR2+巨噬细胞。最左边：次要抗体（2抗体）。中间面板：CD14+CD11b型+巨噬细胞在假血管和血管紧张素II注入的主动脉中被门控，并被鉴定为CCR2+CD11b型+（红色，右侧面板）。
图3
图3。抄送2–/–小鼠对Ang II产生迟钝反应，但过继性转移抄送2+/+单核细胞恢复细胞因子分泌和剥离。
(A类)主动脉CD14定量+CD11b型+80层/四层+假手术和血管紧张素II治疗的巨噬细胞抄送2–/–老鼠。(B类)假手术组主动脉外植体培养中分泌的IL-6和MCP-1浓度(n个=6）或Ang II–注入(n个= 7)抄送2–/–老鼠。数据为平均值±SEM。*P（P）<0.03与假治疗（学生t吨测试）。(C类)DiR800标记的全动物成像抄送2+/+单核细胞抄送2–/–接受或不接受Ang II治疗的小鼠。单核细胞（绿色）位于脾脏背部（S）；肝脏（左），腹侧。非特异性肠道自身荧光显示为红色。单核细胞体外标记效率显示（右上角）。(D类)主动脉制剂抄送2–/–小鼠接收抄送2–/–或抄送2+/+单核细胞成像。3只单独的动物的肾上腺（S）和主动脉根部/升主动脉（As）区域如图所示（参见补充图7）。(E类)原位DHE染色。对照组或注入Ang II的小鼠（6天）的主动脉被分为上升段、下降段、肾上段和肾下段，并在DHE中孵育（氧化显示为红色）。细胞核DAPI染色（蓝色）。比例尺：50μm；原始放大倍数，×200。(F类)在假手术组主动脉外植体培养基中测量分泌的IL-6和MCP-1浓度(n个=5）或Ang II–注入(n个= 6)抄送2–/–小鼠接收抄送2+/+或抄送2–/–单核细胞。数据为平均值±SEM。显示了显著值（双向方差分析P（P）代表Ang II效应、Ccr2基因型效应以及Ang II与基因型[AngII*Ccr2]的相互作用效应的值）。(G公司)血管紧张素II输注后的主动脉横截面抄送2–/–老鼠。顶部：假处理；底部：抄送2+/+单核细胞-注入。比例尺：10μm；原始放大倍数，×100。
图4
图4。小鼠升主动脉中巨噬细胞、AoAFs和细胞因子的定位以及人类组织中散发的A型主动脉夹层中IL-6的定位。
(A类)PKH26标记抄送2+/+单核细胞（红色）被转移到抄送2–/–老鼠。在从外膜/中膜边界侵入中膜的上行夹层动脉瘤的横切面上检测到标记的巨噬细胞，同时夹层处的弹性板层破裂。细胞核DAPI染色（蓝色；右侧）。小图片显示了体外标记的单核细胞。(B类)Ang II治疗的升主动脉横切面（6μm）中IL-6、MCP-1和AoAF的免疫荧光染色抄送2–/–小鼠注射抄送2+/+单核细胞（阳性染色显示为红色）。细胞核DAPI染色（蓝色）。弹性薄片为绿色。(C类)对人类A型散发性夹层进行IL-6染色（红色）。注意IL-6染色主要是外膜（左侧），而不是内层或内膜（右侧）。弹性薄片为绿色。苏木精用作副染色。A、 外膜；M、 媒体；I、 内膜。原始放大倍数，×200。
图5
图5。伊尔6–/–小鼠对Ang II的反应迟钝。
(A类)在假注射或Ang II的主动脉外植体培养基中测量分泌的MCP-1伊尔6–/–6天后的小鼠(n个=每组7人）。数据为平均值±SEM*P（P）与虚假治疗（学生的t吨测试）。(B类)常驻CD14+CD11b型+80层/四层+巨噬细胞存在于主动脉伊尔6–/–老鼠。注入血管紧张素II的小鼠主动脉中的数量增加。未发现动脉瘤。(C类)比较Ang II注入的WT小鼠（绿色曲线）、主动脉夹层动脉瘤（红色曲线）和Ang II注射的WT鼠主动脉巨噬细胞群CD14、CD11b和F4/80表达的直方图伊尔6–/–小鼠（紫色曲线）。(D类)主动脉巨噬细胞用抗对-Tyr705-STAT3抗体（p-STAT3）染色。CD14号机组+CD11b型+sham-treated WT小鼠的巨噬细胞为p-STAT3–，而在Ang II输注的WT小鼠中的那些是p-STAT3+.CD14+CD11b型+假注射和Ang II中的巨噬细胞伊尔6–/–小鼠为p-STAT3–. (E类)按基因型分类的解剖发生率总结。对于每种基因型，显示了6天和10天Ang II输注的主动脉夹层发生率。在括号中，剖切数表示为分子；分母是分析的总数。每个基因型的假融合小鼠在每个时间点都没有出现解剖（未显示）*P（P）<0.004与假输液6天，Fischer精确试验，单侧；#P（P）<0.01与抄送2–/–，Fischer精确检验，单面；在相同基因型和天数下，NS与假治疗相比无显著性差异。
图6
图6。单核细胞与AoAFs共培养诱导IL-6、MCP-1和单核细胞向巨噬细胞分化。
(A类)与人AoAFs培养的THP-1单核细胞诱导的IL-6与细胞间接触无关。数据为平均值±SD(n个=每组3个），通过单因素方差分析进行比较(P（P）=0.003）通过Tukey的事后检验确定各组之间的显著性*P（P）与单独的AoAF相比<0.05。(B类)Giemsa染色显示THP-1单核细胞和来自共培养的巨噬细胞的形态。原始放大倍数，×200。(C类)THP-1细胞和衍生巨噬细胞在IL-4/GM-CSF存在下的CD14染色直方图（蓝色曲线）。同型控制曲线为实心红色。与THP-1细胞相比，THP-1衍生巨噬细胞（右）CD11b染色也增加（中）。(D类)与存在IL-4/GM-CSF的单个培养物中产生的细胞因子总和相比，脐血单核细胞和成人外周血单核细胞核共同培养可诱导IL-6和MCP-1。数据为平均值±标准偏差。#P（P）与来自单一培养物的IL-6水平之和相比，<0.05*P（P）<0.05与单一培养物中MCP-1水平之和，学生的t吨测试。(E类)在IL-4/GM-CSF中培养外周血单核细胞可产生iDC，但在与人AoAF共培养时，细胞分化为巨噬细胞。原始放大倍数，×200。
图7
图7。共培养中单核细胞向巨噬细胞的分化依赖于IL-6。
(A类)上图：IL-4/GM-CSF诱导外周血单核细胞成为CD1a+CD14号机组–（iDC）。与人AoAFs共培养将单核细胞分化为CD1a–CD14号机组+巨噬细胞（巨噬细胞通过HLD-DR从成纤维细胞中分离+浇口）。添加抗IL-6和抗sIL-6R抗体可降低CD14的表达。直方图比较了iDC（蓝色）、巨噬细胞（绿色）和存在抗IL-6/sIL-6R（橙色）的细胞上的CD14染色。同位素对照为红色。底部：平行实验表明iDC为CD14–CD11b型+，巨噬细胞为CD14+CD11b型+IL-6的抑制降低了巨噬细胞上CD11b的表达。插图（右下）：IL-6抑制降低THP-1细胞中CD11b的表达。(B类)在共培养中抑制IL-6（左）可降低MCP-1和MMP-9的水平（与A类). (C类)IL-6刺激THP-1单核细胞在48小时内增加MCP-1 mRNA，而分泌的MCP-1在96小时内继续增加*P（P）与基线相比≤0.001(n个= 3). 中的数据B类和C类均为平均值±标准偏差，并使用单因素方差分析（ANOVA）与多重比较和Tukey的组间显著性事后检验进行比较。
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