Protein kinase Cdelta supports survival of MDA-MB-231 breast cancer cells by suppressing the ERK1/2 pathway

doi:10.1074/jbc.M109.036186

.2009年11月27日；284(48):33456-65.

doi:10.1074/jbc。M109.036186。 Epub 2009年10月15日。

蛋白激酶Cdelta通过抑制ERK1/2通路支持MDA-MB-231乳腺癌细胞的生存

格里·卡尔斯塔德·勒纳¹, Katarzyna Chmielarska Masoumi公司, 约翰·伦纳特森, 克里斯特·拉尔森

附属公司

PMID： 19833733
预防性维修识别码： PMC2785190型
内政部： 10.1074/jbc。M109.036186

蛋白激酶Cdelta通过抑制ERK1/2通路支持MDA-MB-231乳腺癌细胞的生存

格里·卡尔斯塔德·勒纳等。生物化学杂志. 2009.

.2009年11月27日；284(48):33456-65.

doi:10.1074/jbc。M109.036186。 Epub 2009年10月15日。

作者

格里·卡尔斯塔德·勒纳¹, Katarzyna Chmielarska Masoumi公司, 约翰·伦纳特森, 克里斯特·拉尔森

附属

¹隆德大学实验医学系分子病理学中心和瑞典马尔默大学医院。

PMID： 19833733
预防性维修识别码： PMC2785190型
内政部： 10.1074/jbc。2009年3月186日

摘要

介导细胞凋亡抵抗的机制是很有吸引力的癌症治疗靶点。蛋白激酶Cdelta（PKCdelta）在许多细胞类型中被认为是促凋亡因子。然而，在乳腺癌中，它同时显示了促生存和促凋亡作用。在这里，我们首次报道PKCdelta下调本身会导致MDA-MB-231细胞凋亡。PD98059或U0126抑制MEK1/2可抑制PKCdelta缺失MDA-MB-231细胞的凋亡诱导，但不支持MCF-7或MDA-MB-468细胞的存活。MDA-MB-231细胞中的基础ERK1/2磷酸化显著高于其他细胞系。PKCdelta缺失导致ERK1/2磷酸化水平更高，ERK1/2磷酸酶MKP3表达水平更低。MKP3耗竭导致细胞凋亡和ERK1/2磷酸化水平升高，提示这可能是介导PKCdelta下调作用的机制。然而，PKCdelta沉默也诱导了MEK1/2磷酸化的增加，这表明PKCdelta可调节ERK1/2上游和下游的磷酸化。此外，PKCdelta沉默导致E3泛素连接酶Nedd4水平升高，Nedd4是MKP3的潜在调节因子，因为下调导致MKP3水平升高。我们的研究结果强调PKCδ是治疗具有高活性ERK1/2途径的乳腺癌的潜在靶点。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**PKC沉默对乳腺癌细胞生长和死亡的影响。**MDA-MB-231型(A类,B类,E类、和*I–K型*)和MCF-7(C类,天、和F类)用靶向PKCα（α）、PKCδ（δ）或PKC（δ）的siRNA寡核苷酸模拟处理或转染乳腺癌细胞。MDA-MB-231细胞也转染了靶向PKCδ的两个单独的siRNA(*G公司*)和PKCϵ(*H（H）*). 细胞在完全培养基中进一步培养24小时，然后收获进行Western blotting(A类,C类,*G公司*,*H（H）*、和*K（K）*)，进行WST-1分析(B类和天)进行annexin V-APC染色和流式细胞术分析(*E–H（E–H）*)或进行碘化丙啶染色，然后评估核形态(我和J).箭头在里面J表示凝聚核和/或碎裂核。数据（平均值±S.E。，n个=3）表示在控制条件下获得的活细胞百分数(B类和E类)，annexin V阳性细胞百分比(C类和F类)，与对照条件相关的膜联蛋白V阳性细胞百分比(*G公司*和*H（H）*)或有凋亡细胞核的细胞百分比(我). 蛋白质印迹是三个独立实验的代表。星号表示具有统计学意义的差异（*，第页< 0.05; **,第页<0.01）与模拟处理细胞相比(B类和*D–I型*)或Z-VAD-fmk处理细胞(我).二甲基亚砜，二甲基亚砜。

**图2。**
**PKCδ和PKCϵ的自由催化域诱导乳腺癌细胞凋亡。**MDA-MB-231型(A类)和MCF-7(B类)用编码全长的载体转染细胞(*佛罗里达州*)PKCδ或PKCϵ或其自由催化域(光盘)融合到EGFP或EGFP单独培养24小时，然后固定并用碘化丙啶染色。通过EGFP荧光鉴定的转染细胞，对凋亡细胞核形态进行评分，或对EGFP和肌动蛋白进行Western印迹。数据（平均值±S.E。，n个=3）显示转染细胞的凋亡细胞核形态百分比。星号表示具有统计学意义的差异（*，第页< 0.05; **,第页与EGFP转染的细胞相比，差异有显著性（P<0.01）。分子质量标记的位置（以千道尔顿为单位）表示为左边和EGFP融合蛋白的位置显示给*正确的*EGFP印迹中有一些非特定的条带。

**图3。**
**PKCδ缺失通过ERK1/2途径诱导MDA-MB-231细胞死亡。**用靶向PKCα（α）、PKCδ（δ）、PKC-（δ）或对照寡核苷酸的siRNA模拟处理或转染MDA-MB-231细胞(*c（c）*)并在完整培养基中培养24小时，然后进行膜联蛋白V分析(*A–D*)或采收用于免疫印迹(E类和*H（H）*). 如有指示，50μ米PD98059型(A类), 20 μ米U0126号机组(B类)，0.3或1μ米索拉菲尼布(C类), 10 μ米SB203580或20μ米SP600125型(天)或等量的二甲基亚砜(*二甲基亚砜*)从转染开始就存在。通过Western blotting分析所示乳腺癌细胞系的全细胞裂解物(*G公司*). 磷-ERK(*磷酸化细胞外信号调节激酶*)印迹*G公司*暴露的时间比E类因为与MDA-MB-231细胞相比，T47D、MCF-7和MDA-MB-468细胞中磷酸化ERK的基础水平较低。中的数据F类（平均值±S.E。，n个=3）是E类.中的数据*A–D*（平均值±S.E。，n个=3）显示膜联蛋白V阳性细胞的百分比。蛋白质印迹是三个独立实验的代表。星号表示具有统计学意义的差异（*，第页< 0.05; **,第页<0.01）。

**图4。**
**PKCδ缺失导致MKP3下调。**用靶向PKCα（α）、PKCδ（δ）、PKC-（δ）或对照寡核苷酸的siRNA模拟处理或转染MDA-MB-231细胞(*c（c）*)或与靶向MKP3的两种不同的siRNA结合(#1和#2)并在完全培养基中培养24小时，然后收获进行Western blotting(A类,天,F类,*G公司*、和我)或进行annexin V分析(E类). 如有指示，20μ米U0126，10μ米在收获前6小时添加MG132或等量的二甲基亚砜(我). 在C类，对在完全培养基中生长的指示乳腺癌细胞系的全细胞裂解物进行Western blotting。中的数据B类（平均值±标准偏差。，n个=3）是控制和PKCδsiRNA的量化A类中的数据E类（平均值±S.E。，n个=3）显示膜联蛋白V阳性细胞的百分比。中的数据*H（H）*（平均值±S.E。，n个=3）是*G公司*.蛋白质印迹是三个独立实验的代表星号表示具有统计学意义的差异（*，第页< 0.05; **,第页<0.01）。*磷酸化细胞外信号调节激酶*，磷酸-ERK。

**图5。**
**PKCδ缺失导致Nedd4上调，从而抑制MKP3水平。**用靶向PKCδ的siRNA转染MDA-MB-231细胞(#1或#2)、Nedd4（#1或#2)或对照寡核苷酸(*c（c）*)并在完全培养基中培养24小时，然后收获进行Western blotting。在天，对在完全培养基中生长的指示的乳腺癌细胞系的全细胞裂解物进行蛋白质印迹。中的数据B类（平均值±S.E。，n个=3）是A类.蛋白质斑点(A类和*C–E类*)是三个独立实验的代表。星号表示具有统计学意义的差异（**，第页<0.01）。

**图6。**
**抑制ERK1/2通路不会增加MCF-7或MDA-MB-468乳腺癌细胞的存活率。** A类用靶向PKCα（α）、PKCδ（δ）或PKCϵ的siRNA模拟处理或转染MCF-7细胞。如有指示，50μ米PD98059在转染开始时出现。随后对细胞进行膜联蛋白V染色和流式细胞术。B类和C类用靶向PKCα、PKCδ或PKCϵ的siRNA模拟处理或转染MDA-MB-468。随后通过Western blotting分析细胞PKC亚型的表达(B类)或通过annexin V染色进行细胞死亡。天，MDA-MB-468细胞转染对照组(*c（c）*)或PKCδsiRNA，如有指示，50μ米PD98059在转染开始时出现。annexin V染色分析细胞死亡。数据为平均值±S.E(n个= 2 (A类和天)或n个= 3 (C类))并以annexin V阳性细胞百分比表示。星号表示具有统计学意义的差异（**，第页<0.01）与对照转染细胞相比(C类).二甲基亚砜，二甲基亚砜。

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1. Ghayur T.、Hugunin M.、Talanian R.V.、Ratnofsky S.、Quinlan C.、Emoto Y.、Pandey P.、Datta R.、Huang Y.、Kharbanda S.、Allen H.、Kamen R.、Wong W.、Kufe D.（1996）《实验医学杂志》184、2399–2404-项目管理咨询公司-公共医学
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