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.2009年10月；5（10）：e1000609。
doi:10.1371/journal.ppat.1000609。 Epub 2009年10月9日。

病毒Bcl-2介导的逃避自噬有助于γ-疱疹病毒68的慢性感染

小飞E 1, 黄承民（Seungmin Hwang）, Soohwan哦, 李宗洙, 约瑟夫·H·琼, 优桑·格瓦克, 蒂莫西·科瓦利克, 任荪, Jae U Jung先生, 华裔科学家梁澄玉
附属公司

病毒Bcl-2介导的自噬逃避辅助γ-疱疹病毒的慢性感染68

小飞E等。 公共科学图书馆病理学. 2009年10月.

摘要

γ-疱疹病毒（Gamma-Herpesvirus，gammaHVs）与宿主发生了相互作用，在这种相互作用中，它们建立了终身持续感染，并与各种恶性肿瘤的发病有关。小鼠γ-疱疹病毒68（gammaHV68）持续存在的一个关键毒力因子是Bcl-2蛋白的病毒同源物（vBcl-2），该蛋白被认为可以对抗宿主的凋亡反应和自噬途径。然而，vBcl-2的两种活性在病毒持续感染中的相对重要性尚未阐明。在这里，通过对vBcl-2的一系列功能丧失突变体进行表征，我们区分了vBcl-2-介导的自噬拮抗作用和vBcl-2-介导的体内外凋亡抑制作用。缺乏vBcl-2抗自噬活性的突变型gammaHV68病毒显示出在小鼠中维持慢性感染的能力受损，而缺乏vBcl-2抗凋亡活性的突变病毒建立慢性感染的效率与野生型病毒相同，但显示出体外再激活能力受损。因此，vBcl-2介导的宿主自噬拮抗作用构成了一种新的机制，通过这种机制，γ-HV可导致持续感染，进一步强调了自噬作为γ-疱疹病毒体内潜伏期的关键宿主决定因素的重要性。

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数字

图1
图1。酵母双杂交系统中与Beclin1相互作用的野生型（WT）和突变体vBcl-2结构的示意图。
vBcl-2的171-氨基酸序列显示在顶部，α-螺旋结构根据之前的出版物编号。彩色方框表示vBcl-2中的BH 1–4域。“+”：积极互动，“−”：无互动。五十： 连接区；TM：跨膜结构域；三箭头表示vBcl-2 BH1结构域内Ser85-Gly86-Arg87处的丙氨酸替换。
图2
图2。vBcl-2与Beclin1的相互作用。
（A） Beclin1与WT或突变vBcl-2的共免疫沉淀（Co-IP）。用指示的构建物瞬时转染293T细胞，然后免疫沉淀HA标记的vBcl-2和免疫印迹V5标记的Beclin1。（B） WT或突变vBcl-2与内源性Beclin1的Co-IP。用指示的vBcl-2构建体转染293T细胞，然后进行HA标记的vBcl-2的免疫沉淀和内源性Beclin1的免疫印迹。使用1%全细胞裂解物（WCL）作为输入。（C） vBcl-2与Bak蛋白的相互作用。如图所示，用WT和vBcl-2突变形式转染293T细胞。在转染后48小时，将WCL与GST BakΔTM融合蛋白（左图）或单独与GST（右图）混合，用于体外GST下拉（GST PD）测定。显示了用于下拉分析的GST融合蛋白（底部面板）。1%WCL用作输入。数据代表了至少三个产生类似结果的实验。
图3
图3。vBcl-2突变蛋白的抗自噬活性。
（A） 用GFP-LC3转染稳定表达WT的NIH3T3细胞和突变型vBcl-2。在转染后18小时，细胞在正常或饥饿条件下培养4小时。自噬被量化为三个独立实验综合结果的平均值±SEM。**，P（P）<0.0001. （B） 用GFP-LC3转染表达WT或所示vBcl-2突变形式的NIH3T3细胞，并用2µM雷帕霉素处理6 h。使用倒置荧光显微镜（顶部）检测GFP-LC3。自噬被量化为三个独立实验综合结果的平均值±SEM。比例尺，5µm；**，P（P）<0.01. （C） 如图所示，用2µM雷帕霉素处理稳定表达WT或vBcl-2突变形式的NIH3T3细胞。然后用抗LC3抗体的免疫印迹法测定LC3-I和LC3-II水平（顶部）。底部显示了正常和雷帕霉素处理条件下LC3-II/LC3-I比率的密度定量。从三个独立的实验中获得了类似的结果。
图4
图4。vBcl-2的Beclin1结合α1螺旋是γHV68感染期间抑制自噬所必需的。
（顶部）感染指示病毒（MOI=5）的NIH3T3细胞中GFP-LC3和HA标记vBcl-2（WT和突变体）的典型共焦图像。细胞核用4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）复染。比例尺，5µm。（底部）用GFP-LC3点状染色定量病毒感染细胞的百分比。显示的结果代表三个独立实验（每个实验条件200个细胞）的综合结果的平均值±SEM。*，P（P）<0.01与HA-WT；**，P（P）<0.001与HA-WT。
图5
图5。vBcl-2突变蛋白的抗凋亡活性。
用TNFα和环己酰亚胺（CHX）处理稳定表达WT或vBcl-2突变形式的NIH3T3细胞12 h，然后用台盼蓝排斥试验（A）检测细胞活力，或用TUNEL染色（B）检测细胞凋亡，或用流式细胞术（C）检测caspase 3激活。在高倍放大（60倍放大）下对（B）中的凋亡细胞进行计数。模拟，未经处理。数据表示三个独立实验的综合结果的平均值±SEM。比例尺，100µm（A），5µm，P（P）与载体细胞相比，<0.0001。
图6
图6。WT和重组γHV68病毒的体外和体内裂解复制。
（A） WT和重组γHV68病毒在BHK21细胞中的单步（右）和多步（左）生长曲线。（B） 通过受感染小鼠（左）肺部的病毒滴度或病毒基因组DNA的实时PCR（右）测定经鼻感染后，在5 dpi（向上）和7 dpi（向下）的BALB/c小鼠肺部中WT和突变vBcl-2γHV68病毒的急性复制。每组/实验五只小鼠的平均值±SEM。7 dpi的数据来自两个单独的实验。与WT相比，vBcl-2Δα1和ΔBH2突变体在感染病毒滴度方面没有产生显著不同的结果[对于Δα1]，P（P）====================================================================0.82（第5天）；P（P）====================================================================0.08（第7天）；对于ΔBH2，P（P）====================================================================0.49（第5天）；P（P）====================================================================0.54（第7天）；未成对的t吨-以及肺部病毒基因组负荷[Δα1，P（P）====================================================================0.25（第5天）；P（P）====================================================================0.28（第7天）；对于ΔBH2，P（P）====================================================================0.21（第5天）；P（P）====================================================================0.37（第7天）；未成对的t吨-测试]。不重要。
图7
图7。vBcl-2介导的抑制γHV68体内慢性感染中自噬和细胞凋亡的不同作用。
在12 dpi（A，左）、14 dpi（B，左），21 dpi（C，左，在经鼻感染WT或重组γHV68突变体的BALB/c小鼠中，如所示（每组5只小鼠的平均值±SEM/时间点/实验）。14dpi和28dpi的数据分别来自两个和三个单独的实验。所有脾脏样本中的预制感染病毒可忽略不计。与感染中心滴度的WT相比，在12 dpi（A）、14 dpi（B）和21 dpi（C）时，与Δα1和ΔBH2突变病毒相比，没有显著差异[Δ，P（P）====================================================================0.58（第12天）；P（P）====================================================================0.75（第14天）；P（P）====================================================================0.18（第21天）；对于ΔBH2，P（P）====================================================================0.64（第12天）；P（P）====================================================================0.73（第14天）；P（P）====================================================================0.81（第21天）；未配对的t吨-和病毒基因组载量[对于Δα1，P（P）====================================================================0.85（第12天）；P（P）====================================================================0.76（第14天）；P（P）====================================================================0.96（第21天）；对于ΔBH2，P（P）====================================================================0.56（第12天）；P（P）====================================================================0.73（第14天）；P（P）====================================================================0.25（第21天）；未成对的t吨-测试]。在28 dpi（D）、35 dpi（E）和42 dpi（F）时，与WTγHV68相比，vBcl-2突变病毒的感染中心滴度下降（顶部）具有统计学意义[vBcl-2-Δα1 vs.vBcl-2-AAA（42 dpi），P（P）====================================================================0.46; vBcl-2Δα1与WTγHV68（42 dpi），P（P）====================================================================0.08; 未成对的t吨-测试]。与WTγHV68和vBcl-2ΔBH2突变株相比，在28 dpi（D）、35 dpi（E）和42 dpi（F）时，vBcl-2-Δα1、vBcl-2-AAA和vBcl-2缺失突变株的病毒DNA载量（底部）减少，具有统计显著性，如下所示（未配对t吨-试验）：第28天，vBcl-2Δα1与WTγHV68，P（P）<0.01; vBcl-2AAA与WTγHV68，P（P）<0.01; vBcl-2-null与WTγHV68，P（P）<0.01; vBcl-2Δα1与vBcl-1ΔBH2，P（P）<0.001; vBcl-2AAA与vBcl-2ΔBH2，P（P）<0.001; vBcl-2-全对vBcl-2ΔBH2，P（P）<0.001; 第35天，vBcl-2Δα1 vs.WTγHV68，P（P）<0.05; vBcl-2AAA与WTγHV68，P（P）<0.05; vBcl-2Δα1与vBcl-1ΔBH2，P（P）<0.01; vBcl-2AAA与vBcl-2ΔBH2，P（P）<0.05; 在第42天，vBcl-2Δα1与vBcl-1ΔBH2，P（P）<0.001; vBcl-2AAA与vBcl-2ΔBH2，P（P）<0.001；vBcl-2ΔBH2与WTγHV68，P（P）====================================================================0.33. 感染中心*，P（P）<0.05；**，P（P）<0.01; ***,P（P）<0.001.
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