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.2009年10月；11(10):1022-35.
doi:10.1593/neo.09724。

CXCR7的成像配体依赖性激活

凯瑟琳·E·卢克 1, 穆迪特·古普塔, 杰西卡·M·斯蒂尔, 布拉德利·R·福斯特, 加里·德卢克
附属公司

CXCR7的成像配体依赖性激活

凯瑟琳·卢克等。 肿瘤形成. 2009年10月.

摘要

趋化因子CXCL12被提议在20多种不同癌症中促进原发性肿瘤生长和转移性疾病进展的多个步骤。以前认为CXCL12的功能仅由受体CXCR4控制，但最近发现CXCR7是该趋化因子的第二个受体。CXCR7增加小鼠模型中肿瘤的形成和转移，表明该受体也可能是CXCL12阻断肿瘤作用的关键靶点。为了对CXCR7在完整细胞和活小鼠中的激活进行成像，我们测试了以下假设：趋化因子配体与CXCR7的结合招募了β-受体，β-受体是一个与许多激活的趋化因子和相关七跨膜受体相互作用的胞浆适配器蛋白家族。利用萤火虫荧光素酶蛋白片段互补，我们确定趋化因子配体CXCL12和CXCL11显著增加CXCR7和β-抑制素的结合，并且受体与β-抑止素2优先相互作用。经配体治疗后，CXCR7和β-抑制素2之间的相互作用程度随着时间的推移而增加，而β-抑止素2和CXCR4的短暂结合则相反。β-Arrestin 2增加了表达CXCR7的细胞对CXCL12的摄取，强调了CXCR7和β-arristin 2之间相互作用的功能相关性。在人类乳腺癌原位异种移植模型中，我们使用生物发光成像来量化CXCR7和β-抑制素2相关性的变化。这些研究证明了CXCR7与β-抑制蛋白2的配体依赖性相互作用，其促进趋化因子的积累，并建立了一种在基于细胞的测定和活体小鼠中通过趋化因子和候选治疗剂动态调节CXCR7的成像测定。

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图1
图1
萤火虫荧光素酶PCA用于向CXCR7招募β-arrestin。（A） PCA图显示了萤火虫荧光素酶的NLuc和CLuc片段分别与7-TM受体CXCR7和细胞质适配器分子β-arrestin 2融合。CXCL11或CXCL12与CXCR7的结合将β-arrestin 2招募到受体，使NLuc和CLuc酶片段接近并重建萤火虫荧光素酶活性。生物发光提供了CXCR7和β-arrestin之间蛋白质相互作用的大小和动力学的定量测量。（B） 将CXCR7-NLuc瞬时转染293T细胞，48小时后用流式细胞术检测受体的细胞表面表达。比较显示CXCR7在MCF-7人乳腺癌细胞中的内源性表达。开放符号表示同型控制；固体符号，CXCR7抗体。（C） 用PCA报告子CXCR7-NLuc和β-arrestin 2-CLuc以及组成活性GRK2（GRK2-C20）或空载体对照质粒瞬时转染293T细胞(n个=每种情况4）。细胞还与GL表达质粒共转染，作为转染效率的对照。转染48小时后，对完整细胞中萤火虫荧光素酶生物发光进行定量，并归一化为GL活性。数据是代表三个独立实验的平均值±SEM***P（P）< .005.
图2
图2
β-arrestin 2向CXCR7的趋化因子依赖性招募。用1µ克/毫升CXCL11或CXCL12。添加趋化因子或单独培养基后，完整细胞产生的生物发光被量化约10分钟(n个=每种情况4）。显示未表达任何萤火虫荧光素酶PCA报告子的父母293T细胞进行比较。数据是萤火虫荧光素酶活性±SEM的平均值，是四个独立实验的代表*P（P）< .05; ***P（P）< .005.
图3
图3
β-arrestin 2对CXCR7的时间和剂量依赖性募集，以响应趋化因子配体。（A和B）稳定转导的CXCR7/β-arrestin 2 PCA报告细胞与增加浓度的CXCL11（A）或CXCL12（B）孵育不同时期，然后在完整细胞中量化生物发光(n个=4，代表三个独立实验）。数据报告为光子相对于非模拟细胞中控制值的倍数增加。误差棒，SEM。（C）报告细胞用10 ng/ml CXCL12孵育2小时，用PBS洗涤，然后在没有趋化因子的情况下孵育0.5或4小时。对照细胞保存在正常培养基中，不添加趋化因子。数据表示为平均值±SEM，相对于对照细胞的值1(n个=4每种条件，代表两个独立实验）。（D） 在量化活细胞中萤火虫荧光素酶活性之前，用100 ng/ml CXCL12孵育稳定转导CXCR7/β-arrestin 2 PCA或CXCR4/β-arrestin 2 CPA报告子的293T细胞10分钟或2小时(n个=每种情况4）。数据显示为未经处理的细胞相对于基线值的发光增加，误差线表示SEM。结果代表了三个独立的实验*P（P）< .05; **P（P）< .01; ***P（P）< .005.
图4
图4
CXCR7和β-抑制蛋白2的配体依赖性共定位。用CXCR7-GFP和β-arrestin 2-mCherry转染293T细胞，并在与300 ng/ml CXCL12孵育2小时前后进行成像。在基础条件下和CXCL12治疗后显示绿色、红色和合并的荧光图像。蓝色箭头显示CXCR7-GFP和β-arrestin 2-mCherry在细胞内结构中的共定位。
图5
图5
在共存非生物发光CXCR4或CXCR7的细胞中诱导互补信号。用CXCR4-mPlum、CXCR7-mPlum或未融合mPlum对照转染稳定表达CXCR7/β-arrestin 2 PCA的293T细胞。用300 ng/ml CXCL12处理细胞2小时，然后量化萤火虫荧光素酶活性，以确定CXCR7和β-抑制素2的相关性。数据表示为相对于100%mPlum控制设置的生物发光诱导百分比，代表三个独立实验(n个=每种情况4）*P（P）< .05; **P（P）< .01.
图6
图6
CXCR7与β-arrestin-2的相关性增强了报告信号。分别用CXCR7 NLuc和β-arrestin 1-CLuc或β-arrestin 2-CLuc瞬时转染293T细胞。细胞与GL共转染以使转染效率正常化。转染48小时后，用增加浓度的CXCL12处理细胞。在添加趋化因子后1小时，对活细胞产生的萤火虫荧光素酶生物发光进行定量(n个=每种情况4），这些值被归一化为GL活动。趋化因子刺激的β-arrestin 1或β-arristin 2向CXCR7募集的生物发光数据表示为相对于未刺激细胞中生物发光的平均值。误差棒、SEM。数据是三个独立实验的代表*P（P）< .05; **P（P）< .01.
图7
图7
小分子对CXCR7β-arrestin 2募集的调节。用CXCR7/β-arrestin 2 PCA稳定转导的（A和B）293T细胞用浓度增加的CXCR7-靶向小分子CCX733（A）或CCX754（B）预处理30分钟。然后将细胞保持在相同浓度的CCX733或CCX754中，并用100 ng/ml CXCL11或CXCL12或溶媒对照处理2小时，然后量化萤火虫荧光素酶的生物发光。对于未经小分子或趋化因子处理的细胞，将发光数据标准化为1。数据为平均值±SEM(n个=每种条件4个，代表三个独立实验）*P（P）< .05; **P（P）< .01.
图8
图8
CXCR4靶向药物对CXCR7与β-抑制素2相关性的影响。用CXCR4靶向抑制剂AMD3100或TF14013处理稳定转导的CXCR7/β-arrestin 2 PCA报告细胞30分钟，然后再添加100 ng/ml CXCL12或对照细胞2小时，然后量化荧光素酶活性。数据是未经CXCR4靶向剂或CXCL12处理的细胞中相对于报告活性的发光平均值±SEM(n个=每种条件4个，代表2个独立实验）*P（P）< .05; **P（P）< .01.
图9
图9
β-arrestin 2调节CXCR7依赖性CXCL12的积累。（A） CXCR7在野生型和β-arrestin 2细胞膜上的表达-/-用流式细胞术测定MEF。图中显示了在未转导细胞中用CXCR7-GFP和内源性CXCR7稳定转导的MEF的直方图。开放符号表示同种对照抗体，填充符号表示CXCR7抗体染色。（B和C）CXCR7-GFP野生型和β-抑制素2-/-将MEFs与≈10 ng/ml CXCL12-GL孵育1小时，然后用PBS（B）或酸性溶液洗涤两次，以在定量生物发光之前从细胞表面去除趋化因子（C）。数据是CXCL12-GL中归一化为生物发光的光子的平均值±SEM，该生物发光是在野生型CXCR7-GFPMEF中测量的，用载体控制(n个=每种条件4个，代表三个独立实验）。（D） 未转染野生型和β-抑制素2-/-MEF用≈10 ng/ml CXCL12-GL培养1小时，然后用C中所述的酸性溶液清洗(n个=4每种条件，代表两个独立实验）*P（P）< .05; **P（P）< .01.
图10
图10
体内乳腺肿瘤异种移植物中β-arrestin 2向CXCR7的募集。用增加浓度的趋化因子CXCL11或CXCL12（A）或CXCR7靶向小分子CCX733或CCX754（B）处理稳定转导CXCR7-NLuc/β-arrestin 2-CLuc PCA的（A和B）MDA-MB-231人乳腺癌细胞2小时。报告生物发光归一化为对照细胞中的荧光素酶活性（相对发光为1），这些数据描述为平均值±SEM(n个=4每种条件，代表两个独立实验）。（C） 雌性SCID小鼠植入MDA-MB-231报告细胞的原位肿瘤异种移植物。在基线条件下（Pre-TX）进行生物发光成像，以测量CXCR7与β-arrestin 2的相关性。第二天，小鼠按照图中所示的剂量接受CCX754治疗，然后在1小时后成像。显示了两种不同小鼠的预处理和1小时研究的配对图像。生物发光以假彩色标尺表示，红色是发射光子的最高级别，蓝色是最低级别。对于匹配的图像对使用相同的伪彩色尺度。（D） 在基线条件下，使用CCX754或溶媒对照药物治疗1或8小时后，形成定量生物发光成像数据。当误差条可见时，数据为平均值±SEM(n个=8个肿瘤）*P（P）< .05; **P（P）< .01; ***P（P）< .001.
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