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.2009年11月；5(8):1099-106.
doi:10.4161/auto.5.8.9825。 Epub 2009年11月13日。

线粒体吞噬和线粒体通透性转变在培养大鼠肝细胞重构中的作用

萨拉·罗德里格斯-恩里克斯 1, Kai一郎, 爱德华多·马尔多纳多, 罗伯特·T·柯林, 约翰·莱马斯特斯
附属公司

线粒体吞噬和线粒体通透性转变在培养大鼠肝细胞重构中的作用

萨拉·罗德里格斯-恩里克斯等。 自噬. 2009年11月.

摘要

在原代培养中，肝细胞脱分化，细胞质发生重塑。在这里，我们的目的是描述线粒体重塑过程中的变化。肝细胞在含有Waymouth培养基的完整血清中培养1至5天。在负载有MitoTracker Green（MTG）、四甲基罗丹明甲酯（TMRM）和/或LysoTracker Red（LTR）的大鼠肝细胞中，共聚焦显微镜显示，在培养的第1天到第3天，线粒体数量和质量减少了约50%。随着线粒体的消失，溶酶体/自噬体增殖了五倍。线粒体含量的降低与（a）电子显微镜观察到的细胞色素c氧化酶活性和线粒体数量的降低以及（b）PGC-1αmRNA表达的大幅降低有关。相比之下，每个细胞的线粒体DNA含量在培养的第一天到第三天保持不变，尽管溴化乙锭（从头合成线粒体DNA抑制剂）导致线粒体DNA从培养的第一天至第三天减少了一半。随着线粒体的消失，它们的MTG标签转移到LTR标记的溶酶体中，这表明自噬降解。多孔荧光分析显示，培养第3天自噬增加了2.5倍，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤以及线粒体通透性转换（MPT）选择性抑制剂环孢菌素A和NIM811也降低了自噬。这些发现表明线粒体自噬（线粒体吞噬）和MPT是培养肝细胞线粒体重构的基础。

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数字

图1
图1
肝重塑期间线粒体含量减少。肝细胞在完全生长培养基中培养1、2、3和5天，用TMRM标记并成像，如材料和方法所述。单个共焦图像代表10个或更多实验。在每个培养日，每个培养肝细胞的线粒体总数通过细胞的整个厚度的图像堆栈进行量化。数值为平均值±S.E.M（n=10）*与第1天相比，p<0.001。
图2
图2
培养1天和3天后肝细胞的电子显微镜检查。显示了培养1天和3天后大鼠肝细胞的透射电子显微照片。在第3天（B），与第1天（A）相比，线粒体含量降低，自噬结构（*）增加（C）。（A和B）是相同的放大倍数。
图3
图3
细胞色素c（c）培养肝细胞的氧化酶活性和线粒体DNA含量。细胞色素c（c）如材料和方法中所述，测定了归一化为nDNA（B）的氧化酶活性（A）和线粒体DNA含量。在（B）中，如图所示，在第1天或第2天用0.5µg/ml溴化乙锭（EtBr）处理培养的肝细胞*（A）中与第1天相比p<0.001，（B）中与未治疗（无）相比p<0.01。
图4
图4
肝细胞重塑过程中酸性细胞器增加。按照材料和方法中的描述，用LTR装载培养的肝细胞以标记酸性细胞器并成像。代表性第1天和第3天肝细胞的亮场（左）和重叠共焦荧光图像堆栈（右）如（A）所示。在（B）中，绘制了每个肝细胞的平均酸性细胞器数量与培养日的关系。数值为平均值±S.E.M（每组10个）*与第1天相比，p<0.001。
图5
图5
肝细胞重塑过程中线粒体移位到酸性细胞器。培养1天和2天的肝细胞与MTG和LTR共同加载并成像，如材料和方法所述。箭头表示绿色荧光线粒体与红色荧光自溶体重叠（彩色叠加的橙色）。下面板显示第2天肝细胞部分细胞质高倍镜下的单个绿色、红色和重叠图像。每个条件下的实验代表5个。
图6
图6
3-甲基腺嘌呤、环孢素A和NIM811抑制自噬体增殖。如材料和方法中所述，使用荧光平板读取器评估培养的肝细胞对LTR的摄取。如图所示，在添加LTR之前，用10mM 3MA、5µM CsA、5µM NIM811或5µM他克莫司（FK506）预处理肝细胞30分钟。数值为平均值±SEM（每组n=16）。在第2天和第3天，除他克莫司外，所有治疗组与未治疗组（无）均存在显著差异（p<0.01）。
图7
图7
培养肝细胞中PGC-1αmRNA的表达。如材料和方法中所述，通过定量RT-PCR测定新鲜分离肝细胞（第0天）以及培养1天和4天后的PGC-1αmRNA。数值为平均值±SEM（每组n=3）*与第0天相比，p<0.01。
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参考文献

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