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.2009年11月；29(21):5657-70.
doi:10.1128/MCB.00735-09。 Epub 2009年8月31日。

Rictor磷酸化位点的特征揭示了S6K1对mTOR复合物2的直接调控

克里斯蒂安·迪布尔 1, 约翰·M·阿萨拉, 布伦丹·D·曼宁
附属公司

Rictor磷酸化位点的特征揭示了S6K1对mTOR复合物2的直接调控

克里斯蒂安·迪布尔等。 摩尔细胞生物学. 2009年11月.

摘要

哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）在两种不同的复合物（mTORC1和mTORC2）中起作用，以控制细胞生长、增殖、存活和代谢。虽然我们对mTORC1调控的理解取得了很大进展，但调控mTORC2的信号机制尚未明确。在本研究中，我们使用液相色谱-串联质谱分析鉴定了核心mTORC2组分Rictor上的21个磷酸化位点。我们发现一个位点T1135经历了生长因子反应性磷酸化，该磷酸化对雷帕霉素非常敏感，并且在mTORC1下游磷酸化。我们发现Rictor-T1135被mTORC1依赖性激酶S6K1直接磷酸化。尽管这种磷酸化事件不影响mTORC2的完整性或体外激酶活性，但Rictor磷酸化位点突变体（T1135A）在野生型或Rictor缺失细胞中的表达导致S473上Akt的mTORC2依赖性磷酸化增加。然而，Rictor-T1135磷酸化似乎并没有调节mTORC2介导的SGK1或PKCα效应。虽然影响Akt的确切分子机制尚不清楚，但T1135的磷酸化刺激Rictor与14-3-3蛋白的结合。我们提供证据表明，Rictor-T1135磷酸化与其他mTORC1依赖性反馈机制（如影响PI3K的IRS-1信号传导的机制）并行作用，以调节Akt对胰岛素的反应。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
LC/MS/MS鉴定的Rictor上的磷酸化位点聚集在仅在脊椎动物直系动物中保守的区域。图示为所示物种的Rictor直系图。通过使用BLAST将全长Rictor直方图与人类Rictor分别对齐来确定相似区域。存在两个主要的同源区域，即高度保守区域A（人类中的氨基酸为8到1050）和不太保守的区域B（人类中为1519到1694）。人类Rictor中代表的区域A和区域B的大小对应于任何其他直系图中最长的保守性延伸。本研究中确定的磷酸化位点根据全长人类Rictor进行编号，并在表1中进行了总结。材料和方法中列出了正交曲线的接入编号。H.s.公司。,智人;D.m.公司。,D.黑腹果蝇;首席执行官。,秀丽线虫;南卡罗来纳州。,酿酒酵母.
图2。
图2。
Rictor在T1135上以胰岛素反应和雷帕霉素敏感的方式磷酸化。（A） 胰岛素和EGF刺激Rictor在磷酸化Akt底物抗体识别的基序上的磷酸化(第页-Akt-sub）。用空载体（V）转染HEK-293E细胞，或用myc标记的mTOR、Rictor、mSIN1.1和mLST8联合转染。在血清饥饿16小时后，细胞要么不受刺激（通道−），要么用胰岛素（250 nM）（通道I）或EGF（25 ng/ml）（通道E）刺激30分钟。用磷酸化Akt底物抗体或myc表位抗体（Blot Ab）免疫印迹抗myc免疫沉淀物（myc IP）。（B） 磷酸化Akt底物抗体识别的基序上内源性Rictor的磷酸化对沃特曼和雷帕霉素敏感。HEK-293E细胞血清饥饿16h；用二甲基亚砜（车道−）、沃特曼（100 nM）（车道W）或雷帕霉素（20 nM）预处理5分钟或用U0126（10μM）（道路U）预处理1小时；并用胰岛素（100 nM）或EGF（20 ng/ml）刺激30分钟，分别用I和E表示。用所示抗体对内源性Rictor的全细胞裂解物或免疫沉淀进行免疫印迹。（C） mTORC2内的Rictor在磷酸化Akt底物抗体识别的基序上磷酸化。如B组所述，HEK-293E细胞在血清中饥饿16 h，并用胰岛素和/或雷帕霉素治疗。内源性Rictor、mSIN1或mTOR的免疫沉淀物用所示抗体进行免疫印迹。请注意，在mSIN1免疫沉淀中检测到的快速迁移带不是在Rictor或mTOR的免疫沉淀中，它是mSIN1的一种亚型，与这些细胞中的mTORC2无关，或者是抗体与之交叉反应的另一种蛋白质。（D） T1135A突变消除了磷酸化-Akt底物抗体检测到的Rictor的胰岛素刺激磷酸化。用空载体（V）、野生型myc-Rictor（WT）或指示的myc-Ricor磷酸化位点突变体转染HEK-293E细胞。如有指示，在用胰岛素（100 nM）刺激30分钟之前，将细胞的血清饥饿16小时。用磷酸Akt底物抗体或myc表位抗体免疫印迹全细胞裂解物和抗myc免疫沉淀物。（E） 磷酸-Akt底物抗体对Rictor-T1135A的残留识别对雷帕霉素不敏感。转染HEK-293E细胞，并如图D所述进行处理，但如有指示，用雷帕霉素（20nM）预处理5分钟。（F） 使用LC/MS/MS总离子电流定量胰岛素和雷帕霉素对四个残基的Rictor磷酸化反应。如图所示，用野生型myc-Rictor转染HEK-293E细胞，血清饥饿16 h，用雷帕霉素（20 nM）预处理5 min，用胰岛素（200 nM）刺激30 min。myc-Rictor在SDS-PAGE凝胶上进行免疫沉淀和分离。切除考马斯蓝染色带，进行蛋白质水解，并进行目标LC/MS/MS分析。相对磷酸化水平由相应胰蛋白酶（S21、T1135和S1219）或乳糜蛋白酶（S1113）肽的LC/MS/MS总离子电流定量确定，显示为归一化为未刺激样品中的水平。虽然检测到大量含有S1113的肽，但没有发现磷酸化的肽。（G） 人类Rictor-T1135周围的序列在脊椎动物中高度保守。对来自相应Rictor直系图的序列进行比对。参见GenBank登录号的材料和方法。印迹右边的数字是分子质量（单位为千道尔顿）。
图3。
图3。
mTORC1依赖于T1135上Rictor的磷酸化。（A） 内源性Rictor-T1135磷酸化的确认[第页-Rictor（T1135）]与磷酸特异性抗体的结合。轻量化衍生里克托+/+和里克托−/−用雷帕霉素（20 nM）预处理MEF 5分钟，然后用胰岛素（100 nM）处理30分钟。显示了指示蛋白质的免疫印迹。*，非特异性带。（B） 验证Rictor磷酸-T1135抗体的特异性。如图2D所示转染HEK-293E细胞，并用所示抗体免疫印迹抗myc免疫沉淀物（myc IP）。五、 空向量；WT，野生型。（C） 对Rictor进行磷酸酶治疗可消除磷酸-T1135抗体的识别。从生长在全血清中的HEK-293E细胞中免疫沉淀内源性Rictor，用小牛肠磷酸酶（CIP）处理，并用磷酸-T1135和总Rictor抗体进行免疫印迹。*，非特异性带。（D） Rictor-T1135在多种细胞类型中被磷酸化。将3T3-L1脂肪细胞、C2C12肌管和HepG2细胞在血清中饥饿16 h，用雷帕霉素（20 nM）预处理5 min，并用胰岛素（100 nM）刺激30 min。对全细胞裂解物进行磷酸化受体T1135和总Rictor免疫印迹。*，非特异性带。（E） Rictor-T1135在连续时间点响应胰岛素的磷酸化。HEK-293E细胞被血清饥饿16小时并刺激指定的时间长度。用指示的抗体对全细胞裂解物进行免疫印迹。*，非特异性带。（F） 氨基酸再喂养刺激Rictor-T1135磷酸化。将HEK-293E细胞血清饥饿16 h，在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中再培养2 h，然后用新鲜DMEM或DMEM和雷帕霉素（20 nM）刺激30 minTSC2系统-缺乏细胞。稳定表达靶向萤火虫荧光素酶（shLUC）或TSC2系统（shTSC2）的血清饥饿16小时，如有指示，用胰岛素（100 nM）刺激30分钟。用指示的抗体对裂解液进行免疫印迹。*，非特异性带。印迹右边的数字是分子质量（单位为千道尔顿）。
图4。
图4。
S6K1磷酸化T1135上的Rictor。（A） 体外激酶分析证明S6K1在磷酸化Akt底物抗体检测到的位点上磷酸化Rictor需要T1135(第页-Akt-sub）。用胰岛素刺激的HEK-293E细胞中的HA-S6K1免疫沉淀进行体外激酶分析。Rictor底物是从用空载体（V）、野生型myc-Rictor（WT）或myc标记版本的Rictor转染的血清饥饿的、雷帕霉素处理的HEK-293E细胞中免疫沉淀的，所述Rictor单独具有T1135A突变或与指示位点的突变相结合。用所示抗体对激酶反应混合物的含量进行免疫印迹。（B） 体外激酶实验证明S6K1可以直接磷酸化Rictor-T1135。如图所示，HA-S6K1是从未经刺激、用胰岛素（100 nM）刺激30分钟或在胰岛素刺激前用雷帕霉素（20 nM）预处理5分钟的缺血清HEK-293E细胞中免疫沉淀而来的。如面板A所述，获得了Rictor底物。（C）在表达雷帕霉素抗性突变体S6K1的细胞中，Rictor-T1135磷酸化变得对雷帕霉素耐药。HEK-293E细胞转染空载体（V）、野生型S6K1（WT）或雷帕霉素耐药突变体S6K1。细胞饥饿16小时，用雷帕霉素（20 nM）预处理10分钟，然后用胰岛素（100 nM）刺激15分钟。用所示抗体对裂解液进行免疫印迹。（D） S6K1是细胞中T1135的胰岛素刺激磷酸化所必需的。用对照（C）非靶向siRNA或靶向S6K1或S6K2的siRNA转染HEK-293E细胞。细胞被血清饥饿16小时，然后未经刺激或用胰岛素（33 nM）刺激30分钟。用所示抗体对裂解液进行免疫印迹。（E） S6K1是生长在全血清中的细胞中T1135磷酸化所必需的。如D组所述，HEK-293E细胞转染siRNAs，并在全血清中生长，在裂解前16 h改变培养基。印迹右边的数字是分子质量（单位为千道尔顿）。
图5：。
图5：。
Rictor-T1135A突变体促进HA-Akt的磷酸化增加，而不改变mTORC2的组装或体外激酶活性。（A） T1135的磷酸化不影响mTORC2组装或体外激酶活性。在血清饥饿16小时后，用myc标记的Rictor（WT）或Rictor-T1135A从HEK-293E细胞裂解液中免疫沉淀mTORC2，如有指示，用胰岛素（100 nM）刺激30分钟。为了证明反应的特异性，使用来自载体（V）转染细胞的myc免疫沉淀，并在添加ATP之前将mTOR激酶域抑制剂LY294002（15μM；LY）添加到指示的激酶反应混合物中。HA-标记，激酶头Akt（HA-Akt杜兰特)作为底物，从缺乏血清的沃特曼处理（100 nM，15分钟）细胞中免疫沉淀。用所示抗体对激酶反应混合物的含量进行免疫印迹。（B） Rictor-T1135A的表达增加了S473处Akt的磷酸化[第页-HEK-293E细胞中的Akt（S473）。HA-Akt与空载体（V）、Rictor（WT）或Rictor-T1135A共表达，并从血清饥饿16 h，然后用胰岛素（100 nM）刺激指定时间的细胞中进行免疫沉淀。HA免疫沉淀物（HA IP）和裂解物用所示抗体进行免疫印迹。
图6。
图6。
Rictor-T1135A促进S473内源性Akt磷酸化增加[第页-Akt（S473）]英寸里克托−/−MEF公司。（A） Rictor-T1135A引入里克托−/−细胞导致内源性Akt磷酸化增加。里克托−/−用空载体（V）、Rictor（WT）或Rictor-T1135A转染MEF，将融合细胞血清饥饿16 h，并用胰岛素（100 nM）刺激指定时间。用所示抗体对裂解液进行免疫印迹。使用ImageJ软件定量免疫印迹中的磷酸化强度。磷化氢Akt（S473）[第页-Akt（S473）]水平除以总Akt和总Rictor水平，并与WT-Rictor表达细胞的零点水平相关。（B） 将Rictor-T1135A引入里克托−/−和野生型细胞相比，这些细胞不影响总SGK1水平、SGK1底物NDRG1的磷酸化或总PKCα水平。按照A组所述对细胞进行转染和处理。用所示抗体对裂解液进行免疫印迹。免疫印迹中的磷酸化强度按A组所述进行量化，标准化为指示蛋白和Rictor的磷酸化总水平，并显示为相对于WT-Rictor表达细胞在10分钟时间点的磷酸化水平。（C） 与短时间雷帕霉素预处理导致的Akt-S473磷酸化增加相比，T1135A表达细胞中胰岛素诱导的Akt-S473磷酸化度增加的幅度较大。里克托−/−如图A所述转染MEFs。将汇合细胞血清饥饿16小时，用雷帕霉素（20nM）预处理5分钟，并在指示的情况下用胰岛素（100nM）刺激10或30分钟。用所示抗体对裂解液进行免疫印迹。免疫印迹中的磷酸化如图B所述进行定量，并显示为相对于未处理的WT Rictor表达细胞在10分钟时间点的量。
图7。
图7。
Rictor-T1135磷酸化产生14-3-3结合位点。（A） 与Rictor-T1135A一样，Rictor-T115D促进Akt-S473的磷酸化增加[第页-Akt（S473）]。里克托−/−用空载体（V）、野生型myc-Rictor（WT）、myc-Rictor-T1135A或myc-Ricor-T1135D转染MEF，将融合细胞血清饥饿16 h，并用胰岛素（100 nM）刺激指定时间。用所示抗体对裂解液进行免疫印迹。（B） Rictor-T1135在体外可介导14-3-3结合。用空载体（V）、野生型myc-Rictor（WT）、myc-Rictor-T1135A或Rictor-T115A的双突变体以及第二候选14-3-3结合位点转染HEK-293E细胞。使用重组GST或GST-14-3-3对相应的裂解物进行GST下拉分析。用所示抗体对下拉蛋白和裂解物进行免疫印迹。（C） Rictor-T1135可介导细胞内14-3-3结合。里克托−/−将MEFs与Flag-14-3-3和空载体（V）、myc-Rictor（WT）或myc-Rictor-T1135A共转染。用所示抗体对生长在全血清中的细胞的抗-Flag免疫沉淀物（Flag IP）和裂解物进行免疫印迹。印迹右边的数字是分子质量（单位为千道尔顿）。
图8。
图8。
影响胰岛素刺激Akt激活的mTORC1依赖性反馈机制模型。胰岛素和IGF1刺激IRS-1与PI3K的结合，从而激活PI3K并增加其产生的磷酸三酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3招募PDK1和Akt到质膜，PDK1磷酸化Akt-T308。通过一种未知的机制，胰岛素和IGF1也激活mTORC2，后者磷酸化Akt-S473，导致Akt的完全激活。活化的Akt直接磷酸化并抑制TSC2，导致Rheb活化并随后刺激mTORC1活化。mTORC1及其下游靶点S6K1均能磷酸化IRS-1上的特异性丝氨酸残基，这种反馈机制对IRS-1向PI3K的信号传导进行负调控。如当前研究所示，S6K1还直接磷酸化T1135上mTORC2的Rictor亚单位，并刺激14-3-3与Rictor结合。S6K1介导的Rictor磷酸化负向调节mTORC2磷酸化细胞中Akt-S473的能力。因此，mTORC1激活触发两种平行的负反馈机制，影响胰岛素/IGF1刺激的Akt磷酸化和激活水平。
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