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.2009年9月；16(9):945-52.
doi:10.1038/nsmb.1648。 Epub 2009年8月16日。

E2 UBC9磷酸化依赖性SUMO偶联的分子基础

菲拉兹·莫希登 1, 艾伦·D·卡皮利, Parizad M Bilimoria公司, 山田友子, 阿扎德·博尼, 克里斯托弗·D·利马
附属机构

E2 UBC9磷酸化依赖性SUMO偶联的分子基础

菲拉兹·莫希登等人。 自然结构分子生物学. 2009年9月.

摘要

磷酸化和小泛素样修饰物（SUMO）结合有助于包含磷酸化依赖性SUMO共有基序（PDSM）的底物的时空调控。肌细胞增强因子2（MEF2）是一种转录因子和PDSM底物，其被SUMO修饰后可促进突触后树突状分化。核磁共振分析显示，人类SUMO E2与磷酸化和非磷酸化MEF2的模型底物以类似的扩展构象相互作用。突变和生化分析确定了一个基本E2表面，该表面增强了SUMO与磷酸化PDSM底物MEF2和热休克转录因子1（HSF1）的结合，但没有增强与非磷酸化MEF2或HSF1的结合，也没有增强非PDSM底物质p53的结合。在体外和体内，突变泛素结合酶UBC9亚型在促进SUMO结合到磷酸化MEF2方面有缺陷，也会损害器官型小脑片的突触后分化。这些数据支持一种E2依赖性机制，该机制是从热休克反应到核激素信号传递到大脑发育的途径中磷酸化依赖性SUMO结合的基础。

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数字

图1
图1
磷酸化依赖性SUMO偶联是由SUMO E2介导的。(一)扩展SUMO共识基序，突出底物赖氨酸和磷酸化丝氨酸残基。(b条)包含人类MEF2家族成员磷酸化依赖性SUMO结合基序（PDSM）的20个氨基酸、HSF1、HSF4、GATA-1、PPARγ、人类Elk1的负电荷氨基酸依赖性SUMO结合基元（NDSM）和包含p53 SUMO共有基序的15个氨基酸的序列比对。每个C末端残基的氨基酸数在括号中表示。(c（c）)上面板；插图显示了SUMO与MEF2结合的SDS-PAGE分析和荧光检测示例P（P）和MEF2，底物浓度为80μM。补充图1和图2中提供了在动力学分析中构建地块时使用的原始数据子集的附加示例。下面板；左图显示了初始反应速率与底物浓度的关系。图右侧的条形图表示个别特异性常数(k个2/K（K）d日)用于野生型Ubc9介导的SUMO与MEF2的接合P（P）（红色）和MEF2（黑色）。条形图（右侧）指示MEF2的折叠首选项P（P）（灰色）表示为MEF2P（P）(k个2/K（K）d日)/MEF2型(k个2/K（K）d日). (d日)HA-SUMO1在293T细胞中与野生型GAL4-MEF2A和GAL4-MEF2A-S408A结合。左侧面板；HA转染293T细胞的GAL4免疫沉淀-SUMO1公司和野生型，K403R或S408A突变型GAL4-MEF2A公司使用所示抗体进行免疫印迹。用抗微管蛋白抗体对总裂解物进行免疫印迹（作为负荷控制）。右侧面板；条形图显示，与按照方法计算的GAL4-MEF2A-S408A相比，HA-SUMO1改性野生型GAL4-MEF2A的增强程度为4.08±1.48。生化分析一式三份。误差线为±1标准偏差。
图2
图2
E2 Ubc9识别PDSM的模型。(一)靠近RanGAP SUMO共有基序的Ubc9的表面表征和静电势（ψ-K-x-E SUMO一致基序，从之前描述的RanGAP和Ubc9之间的复合体获得；PDB ID 2GRN）。三个C末端氨基酸（包括磷酸化丝氨酸残基）的位置是从之前描述的Pin1和磷酸化肽（PDB ID 1F8A）之间的复合物中获得的，并与RanGAP SUMO共识序列结合以模拟PDSM。本文中讨论的相关氨基酸在Ubc9表面上或其附近使用三字母编码进行标记。蓝色代表基本表面，而红色代表酸性表面。(b条)Ubc9:PDSM复合体的模型。Ubc9的结构显示在带状表示中，PDSM残基显示在棒状表示中。SUMO共有基序和三个C末端残基如一使用PyMol对所有结构进行图形化描述。
图3
图3
参与PDSM识别的Ubc9氨基酸残基的动力学和突变分析。(一)上面板；插图显示了Ubc9-K65A介导的SUMO与MEF2结合的SDS-PAGE分析和荧光检测示例P（P）和MEF2，底物浓度为80μM。下面板；左边的图表示初始速率与底物浓度的关系，右边的条形图表示特异性常数(k个2/K（K）d日)Ubc9-K65A介导的SUMO与MEF2偶联P（P）（红色）和MEF2（黑色）。(b条), (c（c）)和(d日)与中类似的数据一，但分别适用于Ubc9-K74A、Ubc9-K76A和Ubc9-K 59A。(e（电子）)条形图指示MEF2的折叠首选项P（P）（灰色）表示为MEF2P（P）(k个2/K（K）d日)/MEF2型(k个2/K（K）d日)适用于野生型Ubc9、Ubc9-K65A、Ubc9-1K74A、Ubc9-K76A和Ubc9-K59A。红色虚线表示Ubc9-介导的SUMO与MEF2结合具有同等偏好P（P）和MEF2。生化测定一式三份。误差线为±1标准偏差。
图4
图4
Ubc9 Lys65对HSF1的PDSM鉴别很重要，但对非PDSM底物p53不重要。(一)上面板；插图显示野生型Ubc9介导的SUMO与HSF1结合的SDS-PAGE分析和荧光检测示例P（P）和HSF1，底物浓度为80μM。下面板；左边的图显示了初始速率与底物浓度的关系，右边的条形图显示了特异性常数(k个2/K（K）d日)野生型Ubc9介导的SUMO与HSF1结合P（P）（红色）和HSF1（黑色）。(b条)与中类似的数据一，但适用于Ubc9-K65A。(c（c）)上面板；插图显示了16μM底物浓度下野生型Ubc9介导的SUMO与p53结合的SDS-PAGE分析和荧光检测示例。下面板；左边的图显示了初始速率与底物浓度的关系，右边的条形图显示了特异性常数(k个2/K（K）d日)用于野生型Ubc9介导的SUMO与p53结合。(d日)与中类似的数据c（c），但适用于Ubc9-K65A。生化分析一式三份。误差线为±1标准偏差。
图5
图5
构成Ubc9基本表面的氨基酸侧链对MEF2的PDSM鉴别很重要体内. (一)转染HA的293T细胞全细胞裂解物的SDS-PAGE分析-SUMO1公司（左面板）或HA-SUMO2公司（右侧面板）和野生型Myc-UBC9公司或使用抗HA、抗Myc或抗管蛋白抗体（负载控制）进行免疫印迹的所示突变亚型。(b条)上面板；转染HA的293T细胞GAL4免疫沉淀物的SDS-PAGE分析-SUMO1公司，表示Myc-UBC9公司等位基因和GAL4-MEF2A公司用抗HA和抗GAL4抗体以及抗myc和抗管蛋白抗体进行免疫印迹（负荷对照）。下部面板；条形图显示了SUMO修饰对野生型GAL4-MEF2A和GAL4-MEF2-S408A的偏好比率，这两种野生型和突变型Ubc9亚型是通过三种独立转染获得的（方法），但Myc-Ubc9-K59A除外，因为技术困难，它是通过两个独立实验计算得出的。SUMO结合比率（GAL4-MEF2A/GAL4-MEF2A-S408A）分别为9.40±3.67、1.24±0.35、0.78±0.43、2.03±1.39和8.30±1.89，适用于Myc-Ubc9、Myc-Ub9-K65A、Myc-Unbc9-K74A、Myc-Ubc9-K76A和Myc-Ub29-K59A。生化分析一式三份。误差线为±1标准偏差。（c） 293T细胞中SUMO2与MEF2A结合。HA转染293T细胞的GAL4免疫沉淀物-SUMO2公司和指示的Myc突变亚型-UBC9公司和GAL4-MEF2A公司用HA和GAL4抗体进行免疫印迹。用myc-Ubc9的myc抗体和用作SDS-PAGE分析负荷控制的微管蛋白抗体对总裂解产物进行免疫印迹。
图6
图6
PDSM辨别缺陷的Ubc9突变体在小脑皮层树突状爪分化方面也存在缺陷。(一)GFP阳性颗粒神经元表达载体（左）、Flag-Ubc9-WT（中）或Flag-Ub9-K65A（右）的典型共焦图像。箭头和箭头分别表示树突爪和轴突。插图显示了树突末端的高清晰度视图。主比例尺为20微米；嵌入比例尺为4微米。星号表示未图示的神经元轴突。(b条)量化Ubc9和Ubc9突变体对大鼠小脑片树突状爪分化的影响。与那些表达Flag-Ubc9 WT表达神经元的细胞相比，表达Flag-Ubc9-K65A、Flag-Ub9-K74A和Flag-Ub29-K76A的颗粒神经元的树突爪数量显著减少（p<0.001；方差分析，随后进行Bonferroni-Dunn事后检验）。表达Flag-Ubc9-WT和Flag-Ubc9-K59A的颗粒神经元彼此之间没有显著差异。(c（c）)用293T细胞转染编码Flag的表达质粒获得的裂解物进行SDS-PAGE分析和免疫印迹-UBC9公司WT或指示UBC9公司突变等位基因。误差线为±1标准偏差。
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