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.2009年8月12日；29(32):10131-43.
doi:10.1523/JNEUROSCI.1707-09.2009。

TrkB通过特定的对接位点调节恐惧学习和杏仁核突触可塑性

加布里埃尔·穆苏梅奇 1, 卡拉·西亚雷塔, 安东尼奥·罗德里格斯-莫雷诺, Mumna Al Banchaabouchi村, 维森特·内格雷特·迪亚斯, 马可·科斯坦齐, 瓦莱丽亚·贝诺, 阿列克谢·埃戈罗夫, 奥利弗·冯·波伦·恩德·哈尔巴赫, 文森佐·塞斯塔里, 何塞·德尔加多·加西亚, 莉莉亚娜·米尼奇埃洛
附属公司

TrkB通过特定的对接位点调节恐惧学习和杏仁核突触可塑性

加布里埃尔·穆苏梅奇等。 神经科学. .

摘要

理解恐惧神经回路的调节显然是神经生物学最重要的目标之一。外界刺激引起的蛋白质磷酸化被认为是神经回路动态变化的主要机制。TrkB（Ntrk2）神经营养素受体酪氨酸激酶主要通过两个磷酸化位点[Y515/Shc位点；Y816/PLCgamma（磷脂酶Cgamma]位点]有效调节突触可塑性并激活信号转导途径。为了确定TrkB下游恐惧学习和杏仁核突触可塑性所需的分子途径，我们使用在这两个位点之一（Y515F或Y816F）携带单点突变的高度定义的基因小鼠模型研究通过这些位点激活的通路与巴甫洛夫恐惧条件反射（FC）以及通过不同杏仁核神经元的野外记录测量的突触可塑性的生理相关性。我们发现，Y816F点突变会损害FC的获得、杏仁核突触可塑性和突触处的CaMKII信号。相反，Y515F点突变影响FC的巩固，但不影响FC对音调的获得，还改变AKT信号。因此，TrkB受体通过两个主要的磷酸化对接位点调节恐惧学习和杏仁核突触可塑性的特定阶段。

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数字

图1。
图1。
联合CS–美国配对受损trkB型可编程逻辑控制器/+突变但正常trkB型SHC公司/+突变体。一个、控制冻结百分比(trkB型重量/+)和突变型(trkB型可编程逻辑控制器/+)来自典型训练试验的小鼠。而对照组小鼠(trkB型重量/+)在训练阶段表现出正常的习得能力trkB型可编程逻辑控制器/+突变体显示CS–US关联受损或高度降低（ANOVA；第页<0.001）。B类,C类，控件(trkB型重量/+)和突变体(trkB型可编程逻辑控制器/+)24小时后，对一组小鼠进行情境恐惧条件反射测试(B类)然后是线索恐惧条件反射(C类).D类，冻结trkB型SHC公司/+突变体在获得阶段与对照小鼠相似(trkB型+/+).E类,F类，在条件反射后20小时，两组小鼠首先进行了情境恐惧条件反射测试(E类)然后是暗示恐惧条件反射(F类).n个=每组小鼠数量。条形代表平均值±SEM。**统计显著（见结果），第页< 0.001; ns，不显著；ITI，试验间隔；血红蛋白，习惯化。
图2。
图2。
LA-BL突触的突触可塑性受损trkB型可编程逻辑控制器/+但不在trkB型SHC公司/+突变体。一个，刺激和记录电极的示意图。B类,C类，符号表示每2分钟绘制一次的平均响应。控制记录20分钟后，显示一列HFS列车，用箭头标记。数据表示为平均值±SEM.S洛杉矶，刺激（外侧杏仁核）；R（右）BL公司，记录（基底外侧杏仁核）。B类，正常E-LTP以trkB为单位SHC公司/+点突变小鼠与对照组的比较trkB型+/+老鼠(第页> 0.1). 对照组小鼠的切片数量为5片(trkB型+/+)八个代表trkB型SHC公司/+老鼠。C类，E-LTP于年废除trkB型可编程逻辑控制器/+老鼠。两者之间的差异trkB型可编程逻辑控制器/+突变体和对照小鼠(trkB型重量/+)具有统计显著性(第页< 0.01). 追踪显示，应用LTP方案前（1）和后（2）60分钟的EPSP。校准：5 ms，0.5 mV。对照小鼠分析的切片数量为6片(trkB型重量/+)和10用于trkB型可编程逻辑控制器/+老鼠。
图3。
图3。
正常的BL-LA突触基底突触传递trkB型可编程逻辑控制器/+老鼠。一个，测量PPF以确定这方面的突触传递在trkB型可编程逻辑控制器/+小鼠与对照组进行比较。百分比表示第二个fEPSP斜率与第一个fEPSP斜率的比值。在10、30、40、50、100和200 ms ISI下测试PPF。基因型之间没有显著差异。误差条与SEM相对应。B类使用AMPA/红藻氨酸受体（CNQX）和NMDA受体（AP-5）拮抗剂分析NMDA和AMPA/红藻氨酸受体在trkB型可编程逻辑控制器/+老鼠。显示了细胞外记录的单一痕迹trkB型重量/+,trkB型可编程逻辑控制器/+、和trkB型SHC公司/+基因型。箭头表示使用CNQX后15分钟或使用AP-5-plus-CNQX 15分钟后的基线EPSP。C类，所有药理实验的总结数据。绘制的是应用CNQX后15分钟EPSP斜率与基线记录的比值。基因型之间没有统计学上的显著差异(第页> 0.1; 学生的t吨测试）。D类,E类，高频刺激期间突触疲劳。在θ突发刺激期间从trkB型重量/+对照动物(D类)和来自trkB型可编程逻辑控制器/+突变小鼠(E类). 将对第四个刺激的反应（用4表示）与对第一个刺激的响应（用1表示）进行比较。F类，与控件和对应的数据trkB型SHC公司/+和trkB型可编程逻辑控制器/+高频刺激期间的突变。标绘是在θ-脉冲刺激期间，四个刺激的脉冲中第四个响应与第一个响应的比率。对于LTP诱导，应用了三次θ脉冲，并显示了所有三次的数据。所有基因型均可观察到突触疲劳，而对照组之间无统计学显著差异，trkB型SHC公司/+、和trkB型可编程逻辑控制器/+老鼠(第页> 0.1; 学生的t吨测试）。
图4。
图4。
长时LTP在以下神经系统的BL–LA突触中严重受损trkB型可编程逻辑控制器/+突变体。一个，刺激和记录电极的示意图。S公司洛杉矶，刺激（杏仁核外侧）；R（右）BL公司，记录（基底外侧杏仁核）。B类,C类绘制TBS刺激前后fEPSP记录的斜率大小。符号表示每4分钟绘制一次的平均反应。对照记录20分钟后，在箭头标记的时间显示HFS。数据表示为平均值±SEM。B类，L-LTP在trkB型SHC公司/+突变体与对照组的比较(trkB型+/+) (第页> 0.1). 对照组小鼠的切片数量为5片(trkB型+/+)和10用于trkB型SHC公司/+老鼠。C类，L-LTP于年废除trkB型可编程控制器/+老鼠。两者之间的差异trkB型可编程逻辑控制器/+突变体和对照小鼠(trkB型重量/+)具有统计学意义(第页< 0.01). 示踪显示应用LTP方案前（1）和后（2）180分钟的EPSP。校准：5 ms，0.5 mV。对照小鼠切片数量为4片(trkB型重量/+)五个人trkB型可编程逻辑控制器/+老鼠。
图5。
图5。
丘脑-外侧杏仁核突触的突触可塑性在两者中均受损trkB型可编程逻辑控制器/+和trkB型SHC公司/+突变体。一个，刺激电极（S）和记录电极（R）的示意图。B类,C类，符号表示每2分钟绘制一次的平均响应。在20分钟的控制记录后，显示HFS，如箭头所示。数据表示为平均值±SEM。B类，E-LTP在trkB型SHC公司/+突变小鼠。第页与对照小鼠相比<0.01(trkB型+/+).C类，E-LTP在trkB型可编程逻辑控制器/+突变体。第页与对照小鼠相比<0.01(trkB型重量/+). 追踪显示，应用LTP方案前（1）和后（2）60分钟的EPSP。校准：5 ms，0.5 mVtrkB型+/+和trkB型SHC公司/+老鼠和五只trkB型重量/+和trkB型可编程逻辑控制器/+老鼠。D类，测量PPF以确定这方面的突触传递在trkB型SHC公司/+和trkB型可编程逻辑控制器/+小鼠与对照组的比较(trkB型+/+和trkB型重量/+）。百分比表示第二个fEPSP斜率与第一个fEPSP斜率的比值。在10、30、40、50、100和200 ms ISI下测试PPF。基因型之间没有显著差异。误差条对应于SEM。E类，与控件和对应的数据trkB型SHC公司/+和trkB型可编程逻辑控制器/+高频刺激期间的突变。标绘是在θ-脉冲刺激期间，四个刺激的脉冲中第四个响应与第一个响应的比率。对于LTP诱导，应用了三次θ脉冲，并显示了所有三次的数据。在所有基因型中均可观察到突触疲劳，而对照组和trkB型SHC公司/+和trkB型可编程逻辑控制器/+老鼠(第页> 0.1; 学生的t吨测试）。
图6。
图6。
长期LTP在trkB型SHC公司/+和trkB型可编程逻辑控制器/+丘脑-外侧杏仁核突触的突变体。一个，刺激电极（S）和记录电极（R）的示意图。B类,C类绘制TBS刺激前后fEPSP记录的斜率大小。符号表示每4分钟绘制一次的平均反应。对照记录20分钟后，在箭头标记的时间呈现HFS。数据表示为平均值±SEM。B类，L-LTP在trkB型SHC公司/+突变体与对照小鼠的比较(trkB型+/+);第页< 0.01.C类，L-LTP也显著降低trkB型可编程逻辑控制器/+小鼠与对照小鼠的比较(trkB型重量/+);第页< 0.01. 示踪显示应用LTP方案前（1）和后（2）180分钟的EPSP。校准：5 ms，0.5 mV。分析四个切片trkB型+/+老鼠，六只trkB型SHC公司/+老鼠，五只trkB型重量/+和trkB型可编程逻辑控制器/+老鼠。
图7。
图7。
空间学习严重受损trkB型可编程逻辑控制器/+但不在trkB型SHC公司/+点突变体。A–D，小鼠在完全诱饵的八臂径向迷宫中连续训练10天。学习成绩表示为前8次试验中正确选择手臂的平均数，这是一种空间工作记忆的测量方法(一个,B类)，以及在观察到八个正确选择之前或在最大允许试验次数（15次）之后的错误百分比，这反映了长期空间记忆(C类,D类).A、 C类，的性能trkB型可编程逻辑控制器/+与trkB型重量/+在所有考虑的措施中控制小鼠。B、 D类，相比之下trkB型SHC公司/+小鼠与trkB型+/+在前八次试验中，控制小鼠选择正确的手臂和错误率*第页<0.05；#第页< 0.005.
图8。
图8。
杏仁核突触pCaMKII弱trkB型可编程逻辑控制器点突变与恐惧获取受损相关。A–C，免疫印迹显示pCaMKII（Thr286)大鼠杏仁核组织中突触体的水平trkB型+/+未经训练（控制，n个=4）与受过训练（2 CS–US，n个= 5; 或5 CS–美国，n个= 5),trkB型可编程逻辑控制器/+（控制，n个= 3; 2 CS–美国，n个= 3; 或5 CS–美国，n个=3）和trkB型可编程逻辑控制器（PLC/PLC）（控制，n个= 3; 2 CS–美国，n个= 3; 或5 CS–美国，n个=3）小鼠。用CaMKIIαAbs重制斑点，以观察CaMKIα水平。顶部，pCaMKII水平的量化一个，**，方差分析，五个CS–US与对照，第页= 0.0059; *, 两个CS–美国与控制，第页=0.047。B类，*，方差分析，五个CS–US与对照，第页= 0.01; 五个CS（美国）与两个CS（美），第页= 0.03.C类，***，方差分析，五个CS–US与对照，第页= 0.0007; 五个CS–US对两个CS–US，第页= 0.0002.D–F型PSD95和突触素I/II的免疫印迹证实，杏仁核组织的突触体制剂分别含有突触前和突触后部分。
图9。
图9。
pAKT降低，但pMAPK未降低trkB型SHC公司/+点突变体。一个、Top、Immunoblot显示了BDNF刺激对照组和trkB型SHC公司/+使用Abs对抗磷酸化ERK1/2、p42/44（pMAPKs）形式的突变体皮层初级神经元。为了控制蛋白质负荷，用抗ERK1抗体重制印迹。底部，pMAPK水平的量化。对每个抗体的两个不同印迹进行密度分析(n个=每个时间点3个皮层）。B–E类、恐惧症患者杏仁核组织的免疫荧光分析(n个=3）与未经训练(n个= 2)trkB型+/+和trkB型SHC公司/+小鼠使用pMAPKs Abs。F类，Top，免疫印迹显示BDNF刺激对照组和trkB型SHC公司/+使用pAKT抗体突变皮层初级神经元。为了控制蛋白质负荷，用抗AKT抗体重制印迹。底部，pAKT水平的量化。*，pAKT输入trkB型SHC公司/+与trkB型+/+,第页=0.02，无统计学意义。对每个抗体的两个不同印迹进行密度分析(n个=每个时间点3个皮层）。G公司，Top，杏仁核裂解物中pAKT的免疫印迹分析trkB型+/+未经训练（控制）(n个=2）与训练（恐惧条件下）(n个=3）杏仁核裂解物trkB型SHC公司/+小鼠（对照）(n个=2）与受过训练（恐惧-条件反射）(n个=3）杏仁核裂解物。为了控制蛋白质负荷，用抗AKT抗体重制印迹。底部，pAKT水平的量化*第页= 0.01. C、 控制（未经培训）；T、 受过训练。
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