跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

政府意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2009年7月13日；186(1):75-83.
doi:10.1083/jcb.200810179。 Epub 2009年7月6日。

RhoG活性的抑制由syndecan 4-synectin-RhoGDI1复合物介导，并在Rac1激活途径中被PKCalpha逆转

阿耶·埃尔芬贝因 1, 约翰·M·罗兹, 朱莉娅·梅勒, 马丁·施瓦茨, 松田美之, 迈克尔·西蒙斯
附属公司

RhoG活性的抑制由syndecan 4-synectin-RhoGDI1复合物介导，并在Rac1激活途径中被PKCalpha逆转

阿耶·埃尔芬贝因等。 J细胞生物学. .

摘要

成纤维细胞生长因子2（FGF2）是发育、病理和治疗性血管生成的主要调节因子。其活性部分通过与蛋白多糖受体syndecan 4（S4）结合介导。血管生成需要小鸟嘌呤三磷酸酶Rac1的极化激活，这涉及到RhoGDI1的局部解离和质膜的结合。先前的研究表明，S4或其适配器synectin的基因缺失会导致Rac去极化激活、内皮细胞迁移减少和其他生理缺陷。在本研究中，我们表明S4下游的Rac1激活由RhoG激活途径介导。RhoG由RhoGDI1维持在非活性状态，RhoGDI存在于与合成素和S4的三元络合物中。S4与合成素的结合增加了后者与RhoGDI1的结合，从而增强了RhoGDI 1对RhoG的亲和力。S4聚集激活PKCalpha，后者在Ser（96）磷酸化RhoGDI1。这种磷酸化触发RhoG的释放，导致Rac1的极化激活。因此，FGF2诱导的Rac1激活依赖于之前未经特征化的三元S4-连接蛋白-RhoGDI1蛋白复合物对RhoG的抑制和PKCalpha的激活。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
FGF2和S4集群通过RhoG激活Rac1。（a） 在RhoG活性测定之前，RFPEC在0.5%FBS/DME中培养24小时。在裂解和随后的RhoG活性测定之前，用50 ng/ml FGF2处理细胞指定时间。10分钟时观察到RhoG活性峰值。（右）显示了三个实验的定量结果。*，P=0.018。（b） 在RhoG活性测定之前，稳定表达S4-FcR嵌合体的RFPEC同样在0.5%FBS/DME中培养24小时。将S4-FcR嵌合体聚集到指定的时间。（右）显示了三个实验的量化结果。*，P=0.042。（c） 在分析之前，用所示的RhoG构建物转染RFPEC 48小时。转染后24小时，细胞在0.5%FBS/DME中培养。每种情况都表示在50 ng/ml（+）浓度下无刺激（−）或10分钟FGF2刺激。Rac1活性测定进行了三次，并使用改良的ELISA技术进行了量化（参见材料和方法）。*（从左到右），P=0.0008、0.014和0.002。（d） RFPEC被镀在玻璃盖玻片上，并以1:4摩尔比转染Raichu-Rac1和指示的shRNA构建物。在成像之前，用0.5%FBS在1:1 F12/DME中的血清饥饿细胞12小时。在指定的时间点添加FGF2，每分钟对细胞成像一次。图像显示了在每个像素处进行背景减除后计算的伪彩色FRET比率，即YFP荧光/CFP荧光。较高的比值（红色）与较高的Rac1活性相关。棒材，10µm。（e） 在d所示的每种条件下对六个细胞的全细胞FRET比率进行定量。FGF2刺激（+）持续10分钟*，P=0.037。（f） RFPECs转染有指示的结构并在涂有纤维连接蛋白的塑料皿上电镀。这些细胞被培养成融合的单层，此时它们被血清饥饿，并用划痕破坏单层。图像和量化表示迁移的区域，在单层破坏24小时后，用每种条件测量的24帧对三个实验进行平均。所有结果均归一化为非刺激对照细胞的迁移（最左侧条件）。成分活性RhoG（V12）被用作迁移的阳性对照。*（从下到上），P=0.048和0.008。棒材，75µm。所有实验中的P值均使用双样本等方差计算t吨测试。误差条代表SEM。
图2。
图2。
S4介导基线RhoG活性，并与连接蛋白、RhoGDI1和RhoG相关。（a） 在测定RhoG活性之前，将WT和S4基因敲除小鼠的肺微血管内皮细胞在0.5%FBS/DME中培养24 h。β-肌动蛋白和RhoGDI用作负荷对照。（右）显示了三个实验的量化结果。*，P=0.009。误差条显示SEM。（b）与S4的跨膜结构域和细胞质尾部相对应的合成生物素化肽在与链霉亲和素珠结合后被用于下拉蛋白质。用免疫印迹法对拖拉绒毛进行免疫印迹，并检测合成素（顶部）和RhoGDI（底部）表示未结合的链霉亲和素珠。在这两种情况下，只有在与S4尾肽孵育时，目标蛋白才会被拉下。（c） 用抗RhoGDI和synectin的抗体在三种细胞系中进行共免疫沉淀：WT-RFPEC（左）、表达S4-FcR嵌合体的RFPEC（中）和表达S4-Fc嵌合体（右）的RFPECs。β-肌动蛋白作为负荷对照。IP，免疫沉淀。（d） 将与重组RhoGDI1（右）或不含重组蛋白（左）结合的谷胱甘肽珠与RFPEC的裂解物在4°C下孵育12 h。洗涤后，蛋白质通过煮沸变性并进行SDS-PAGE。将蛋白质转移到膜上，并探测RhoG和合成素。（e） 用S4-FcR嵌合体转染RFPEC。细胞用FITC-结合的人IgG孵育以染色嵌合体（左侧），用PBS洗涤两次，固定，渗透，并用RhoGDI1和RhoG抗体染色（分别为中部和右侧）。箭头表示同位化区域。棒材，10µm。
图3。
图3。
基线时RhoG抑制需要Synerctin和RhoGDI1。（a） 在裂解和RhoG活性测定前48 h，用GFP-或4His标记的联结蛋白转染WT小鼠肺微血管内皮细胞。在裂解之前，将细胞在0.5%FBS/DME中血清饥饿24小时。（底部）显示了三个实验的量化结果。*，P=0.052。（b） 转染小鼠RFPEC（左侧和中部）和转染4His标记的合成酶（右侧）的RFPEC在转染48小时后进行裂解。使用与GST-RhoGDI1（中部和右侧）结合的谷胱甘肽珠或单独使用谷胱甘苷珠（右侧）进行拉毛。（c） 将WT和synectin敲除小鼠肺微血管内皮细胞的裂解物归一化为等蛋白浓度，并与单克隆抗RhoGDI抗体和蛋白A/G珠（+）或单独珠（-）孵育。洗涤和蛋白洗脱后，用SDS-PAGE对样品进行分析，并用抗RhoG抗体进行检测。IP，免疫沉淀。（d） 用对照shRNA序列或RhoGDI1特异的shRNA转染RFPEC。转染24小时后，将细胞置于0.5%FBS/DME中再放置24小时，然后对其进行裂解并检测RhoG活性。量化结果显示了三个实验的平均值，并显示用RhoGDI1 shRNA.*（从下到上）处理的细胞的基线RhoG活性增加了两倍以上，P=0.034和0.008。误差条表示SEM。
图4。
图4。
RhoGDI1在Ser的PKCα磷酸化96诱导RhoG激活。（a） 在RhoG活性测定之前，用GFP或GFP-肉豆蔻酰化PKCα腺病毒构建物转导RFPEC 48小时。转染后24小时，细胞在0.5%FBS/DME中血清饥饿，此时收集裂解物。（底部）显示了三个实验的量化。*，P=0.048（双样本等方差t吨测试）。（b） 在RhoG活性测定之前，用指示的构建物转染RFPEC 24小时，并将血清在0.5%FBS/DME中饥饿24小时。磷酸化RhoGDI1（S96D）的表达导致RhoG活化。量化表示三个实验的平均值。*，P=0.038。（c） 利用稳定表达S4-FcR嵌合体的RFPEC对S4的跨膜和细胞溶质结构域进行聚类。用2µg/ml非免疫性人IgG处理这些细胞，并用PBS洗涤两次。用抗人IgG-F（ab′）启动聚类23µg/ml的碎片，持续指定时间。通过免疫印迹分析细胞。一种特异性Ser磷酸化的兔多克隆抗体96用于顶部面板。（d） 转染后72 h，对过度表达所示GFP标记的RhoGDI1突变体的HeLa细胞进行裂解，并用与蛋白A/G珠结合的抗GFP抗体进行免疫沉淀（IP）。免疫印迹检测RhoG。RhoGDI1（S96D）导致RhoG–RhoGDI 1相互作用减少。（e） 用所指示的构建体转染RFPECs，并使血清饥饿。FGF2处理1分钟。随后使用抗磷酸化RhoGDI（Ser96)抗体。FGF2和（肉豆蔻酰化）组成型活性（CA）PKCα均导致RhoGDI1磷酸化Ser96而激酶死亡（KD）PKCα导致该残基RhoGDI磷酸化的基线水平较低。误差条代表SEM。
图5。
图5。
RhoG激活受S4-连接蛋白-RhoGDI1复合物调节。RhoG活性在基线时被S4、联蛋白和RhoGDI1组成的复合物抑制。在这个复合物中，S4增强了synectin–RhoGDI1的结合，synection增加了RhoGDI 1对RhoG的亲和力。在FGF2刺激和随后的S4寡聚化后，PKCα被激活，从而在其Ser磷酸化RhoGDI96残留。这导致RhoG与RhoGDI1分离，之后RhoG被激活。活性RhoG与ELMO1和Dock180结合形成功能性GEF复合体，这是该途径中Rac1激活所必需的。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

  • 基底内皮细胞糖萼对剪切应力的反应：结构、功能和临床意义的综述。
    Vittum Z、Cocchiaro S、Mensah SA。 Vittum Z等人。 前细胞发育生物学。2024年3月18日；12:1371769. doi:10.3389/fcell.2024.1371769。eCollection 2024年。 前细胞发育生物学。2024 PMID：38562144 免费PMC文章。 审查。
  • PLK1磷酸化RhoGDI1并促进癌细胞迁移和侵袭。
    Lim J、Hwang YS、Yoon HR、Yoo J、Yoo SR、Jung H、Cho HJ、Lee HG。 Lim J等人。 《癌症细胞国际》2024年2月14日；24(1):73. doi:10.1186/s12935-024-03254-z。 《癌症细胞国际》2024。 PMID：38355643 免费PMC文章。
  • 跨膜蛋白184a在斑马鱼胚胎血管生成中的作用。
    Field CJ、Perez AM、Samet T、Ricles V、Iovine MK、Lowe-Krentz LJ。 Field CJ等人。 前生理学。2022年9月2日；13:845407. doi:10.3389/fphys.2022.845407。eCollection 2022年。 前生理学。2022 PMID：36117693 免费PMC文章。
  • 静电力介导RHO GTPase-GDI相互作用的特异性。
    Mosaddeghzadeh N、Kazemein Jasemi NS、Majoleée J、Zhang SC、Hordijk PL、Dvorsky R、Ahmadian MR。 Mosaddeghzadeh N等人。 国际分子科学杂志。2021年11月19日；22(22):12493. doi:10.3390/ijms22212493。 国际分子科学杂志。2021 PMID：34830380 免费PMC文章。
  • Syndecan-4在肿瘤细胞运动中的作用。
    Keller Pinter A、Gyulai Nagy S、Becsky D、Dux L、Rovo L。 Keller-Pinter A等人。 癌症（巴塞尔）。2021年7月1日；13(13):3322. doi:10.3390/cancers1313322。 癌症（巴塞尔）。2021 PMID：34282767 免费PMC文章。 审查。
查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Alexopoulou A.N.、Multhaupt H.A.、Couchman J.R.，2007年。Syndecans在伤口愈合、炎症和血管中的作用生物学。国际生物化学杂志。细胞生物学。39:505–528-公共医学
    1. Aoki K.、Nakamura T.、Fujikawa K.、Matsuda M.，2005年。局部磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸积累招募Vav2和Vav3激活Rac1/Cdc42，并在神经生长因子刺激的PC12细胞中启动突起生长。分子生物学。单元格。16:2207–2217-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bass M.D.、Roach K.A.、Morgan M.R.、Mostafavi-Pour Z.、Schoen T.、Muramatsu T.、Mayer U.、Ballesterm C.、Spatz J.P.、Humphries M.J.，2007年。Syndecan-4依赖的Rac1调节决定了细胞外基质的定向迁移。细胞生物学杂志。177:527–538-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Brunet N.，Morin A.，Olofson B.，2002年。RhoGDI-3调节RhoG，并通过其独特的N末端结构域将该蛋白靶向高尔基复合体。交通。3:342–357-公共医学
    1. Chittenden T.W.、Claes F.、Lanahan A.A.、Autiero M.、Palac R.T.、Tkachenko E.V.、Elfenbein A.、Ruiz de Almodovar C.、Dedkov E.、Tomanek R.等人，2006年。合成素对动脉分支形态发生的选择性调节。开发单元。10:783–795-公共医学

出版物类型

MeSH术语