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。2009年7月15日；183(2):1320-7.
doi:10.4049/jimmunol.0803206。 Epub 2009年6月26日。

急性和慢性酒精对脂多糖诱导炎症的相反作用与人类单核细胞中的IRAK-M有关

Pranti Mandrekar公司 1, 沙市巴拉, 唐娜·卡塔拉诺, 凯伦·柯迪斯, Gyongyi Szabo公司
附属公司

急性和慢性酒精对脂多糖诱导炎症的相反作用与人类单核细胞中的IRAK-M有关

Pranti Mandrekar公司等。 免疫学杂志。 。

摘要

饮酒后宿主防御受损与细胞因子产生的改变有关，然而，急性和慢性酒精对单核细胞/巨噬细胞的激活调节不同。我们假设，在人类单核细胞中，急性酒精诱导对LPS的低反应性，导致TNF-α降低，而慢性酒精通过对LPS致敏增加TNF-β。我们发现，急性酒精增加了人单核细胞中IL-1R相关激酶单核细胞（IRAK-M），IRAK-1的负调控因子。这与LPS刺激后IkapaBα激酶活性、NFkappaB DNA结合和NFkappa B驱动的报告活性降低有关。相反，慢性酒精降低了IRAK-M的表达，但增加了IRAK-1和IKK激酶活性、NFkappaB DNA结合和NFkappa B报告活性。使用小干扰RNA抑制急性酒精暴露的单核细胞中的IRAK-M可恢复LPS诱导的TNF-α生成，而慢性酒精巨噬细胞中IRAK-M的过度表达可阻止TNF-β生成的增加。在慢性酒精暴露期间，添加酒精代谢抑制剂不会改变LPS信号和TNF-α的产生。IRAK-1激活诱导MAPK在TNF-α诱导中发挥重要作用。我们确定，急性酒精减少，而慢性酒精增加单核细胞ERK的激活，ERK抑制剂PD98059阻止了慢性酒精诱导的TNF-α增加。总之，急性酒精对LPS诱导的NFkappaB和ERK激活的抑制导致单核细胞对LPS的低反应性，这是由于IRAK-M增加所致。相反，慢性酒精通过IRAK-M-表达减少和NFkappa B和ERK-激酶的激活使单核细胞致敏LPS。我们的数据表明，IRAK-M在单核细胞不同长度的酒精暴露对LPS信号的相反调节中起着关键作用。

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利益冲突声明

披露

作者没有经济利益冲突。

数字

图1
图1
急性酒精减少，但慢性酒精治疗人单核细胞增加LPS诱导的TNF-α生产。A类，将人单核细胞暴露于25 mM乙醇（Et）中1至7天，然后进行LPS（100 ng/ml）处理18 h并检测TNF-α用ELISA法在无细胞上清液中检测。TNF平均值-α（微克/毫升/106细胞）±SE（与LPS相比；*，第页< 0.001).B类LPS（100 ng/ml）治疗3 h和TNF-α用特异性TNF实时PCR测定mRNA-α如中所述的底漆材料和方法条形图表示mRNA±SE的折叠诱导（与LPS相比；*，第页<0.01；**，第页< 0.001;n个= 6).
图2
图2
酒精改变IRAK-M和IRAK-1水平，但对CD14和TLR4的表达没有任何影响。A类人单核细胞暴露于25 mM乙醇（Et）1天（急性）或7天（慢性），用CD14和TLR4 Abs染色，并用流式细胞仪进行分析。采用等型IgG抗体作为阴性对照。B类，将人单核细胞暴露于25 mM乙醇中7天（Chr），然后将LPS（100 ng/ml）暴露15分钟。按照材料和方法以髓磷脂碱性蛋白（MBP）为底物进行激酶分析。蛋白质在SDS-PAGE上分离，凝胶显示32P-磷酸化MBP。用IRAK-1抗体免疫印迹法（WB）测定IP样品中的等蛋白。下面的条形图表示闪烁计数器测量的基底中的cpm。（与unt相比；*，第页< 0.01; 与LPS相比；**，第页< 0.05;n个= 4).C类，将人单核细胞暴露于25 mM乙醇（Et）中1天（Ac）或7天（Chr），然后进行LPS（100 ng/ml）处理6小时，并使用特定IRAK-M引物通过实时PCR测定IRAK-MmRNA，如材料和方法条形图表示mRNA±SE的折叠诱导（与unt相比；*，第页< 0.01; 与LPS相比；**，第页< 0.02;n个= 4).D类，单核细胞暴露于25 mM乙醇（Et）中1天（Ac）或7天（Chr），然后进行LPS（100 ng/ml）处理24小时，并使用抗IRAK-M抗体通过免疫印迹法测定IRAK-M-蛋白水平，如材料和方法使用内部控制抗-β-肌动蛋白抗体。
图3
图3
IRAK-M表达调节TNF-α在饮酒期间。A类，用对照siRNA（scr）和IRAK-M特异性siRNA转染原始巨噬细胞（对照细胞），并在暴露于25 mM酒精中48 h后再暴露于LPS中6 h。通过实时PCR和条形图分析总RNA提取物中的IRAK-MmRNA(上部面板)以IRAK-M基因表达百分比表示（与对照组相比；*，第页< 0.009). 通过蛋白质印迹分析在LPS存在或不存在下6小时的全细胞裂解物中的IRAK-M蛋白(中间面板)和上清液分析TNF-αELISA法生产(下部面板). TNF平均值-α（微微克/毫升/106细胞）±SE（与对照siRNA相比；#，第页< 0.007; **,第页< 0.01).B类，将原始264.7个巨噬细胞暴露于慢性酒精中7天，用控制载体或IRAK-M过表达载体（Origene）转染36小时，并在没有(插图图）或与LPS作用6小时。使用抗IRAK-M蛋白进行Western印迹(上部面板)对抗体和上清液进行TNF分析-α通过ELISA(下部面板). TNF平均值-α（微克/毫升/106细胞）±SE（与矢量控制相比；*，第页< 0.01; **,第页< 0.001).
图4
图4
急性酒精减少，而慢性酒精增加LPS诱导的人单核细胞IKK激酶活性。人类单核细胞暴露于酒精（Et）中1天（Ac）或7天（Chr），然后用LPS（100 ng/ml）刺激15分钟。用IKK激发细胞质提取物β使用GST-I对裂解缓冲液中的抗体进行激酶分析κB类α作为基板，如所述材料和方法.蛋白质在SDS-PAGE上分离，凝胶显示32P-磷酸化GST-IκB类α。通过免疫印迹法测定输入样品中的等蛋白载量β-肌动蛋白抗体。条形图表示闪烁计数器测量的基质中的cpm。（与unt相比；*，第页< 0.05; 与LPS相比；#，第页< 0.05; **,第页< 0.01;n个= 3).
图5
图5
急性酒精抑制MAPK-ERK激活，而慢性酒精增加单核细胞中的磷酸-ERK水平。单核细胞暴露于25 mM乙醇（Et）中1天（Ac）或7天（Chr），然后进行LPS（100 ng/ml）处理15分钟。A类、总和磷酸化ERK、磷酸化p38和磷酸化JNK蛋白水平，通过使用如材料和方法。B类，显示了总共六个个体的磷酸-ERK带的平均密度单位±SE。（与LPS相比；*，第页< 0.05; #,第页< 0.02,n个= 6).C类，单核细胞暴露于25 mM乙醇（Et）中7天（Chr），然后与ERK抑制剂（PD98059，50μM） 4 h，用LPS（100 ng/ml）刺激18 h。收集无细胞上清液并检测TNF-α在ELISA中。数据表示为平均值±SE（与LPS相比；**，第页< 0.001; 与Chr-Et加LPS相比；*，第页< 0.02,n个= 6).
图6
图6
急性和慢性酒精暴露促进脂多糖诱导的IκB类α单核细胞降解。将单核细胞暴露于酒精中1（Ac）、4和7天，然后用LPS（100 ng/ml）模拟60分钟。制备细胞质提取物，并用总I进行免疫印迹κB类αAb.条形图表示总共六个人的平均密度单位±SE（与LPS相比；*，第页< 0.02,n个= 6).
图7
图7
急性和慢性酒精暴露对NF的相反影响κB结合活性与人单核细胞的酒精代谢无关。A类，单核细胞暴露于酒精中1（Ac）、4和7天，然后用LPS（100 ng/ml）模拟60分钟NFκEMSA使用32P标记双绞线NFκB寡核苷酸。条形图显示了总共六个人的平均密度±SE（与LPS相比；*，第页< 0.01).B类RAW 264.7巨噬细胞暴露于酒精（Et）中1（ac）或4天（chr），然后瞬时转染NFκ携带5个NF串联拷贝的B报告基因构建物κ萤火虫荧光素酶基因前的B结合位点和Renilla荧光素酶构造。转染后24小时，用LPS（100 ng/ml）处理细胞8小时。然后将细胞裂解以测定萤火虫荧光素酶活性，并将其归一化为Renilla荧光素酶活动。条形图表示荧光素酶基因与总共三个实验的未刺激对照相比的折叠激活。（与LPS相比；*，第页< 0.01; **,第页< 0.02,n个= 3).C类，单核细胞暴露于25 mM乙醇（Et）中1至7天，使用抗CYP2E1抗体通过免疫印迹法测定CYP2E1蛋白水平，如材料和方法条形图表示总共六个人的平均密度±SE。D类，单核细胞与4-甲基吡唑或氰胺一起暴露于酒精中7天，然后用LPS（100 ng/ml）刺激60分钟κ通过EMSA使用32P标记双绞线NFκB寡核苷酸。条形图显示了总共六个个体的平均密度±SE（与unt相比；*，第页< 0.001; 与LPS相比；**，第页< 0.001).E类，单核细胞暴露于25 mM乙醇（Et）和4-甲基吡唑或氰胺中7天（Chr），然后用LPS（100 ng/ml）刺激18小时。收集无细胞上清液并检测TNF-α在ELISA中。数据表示为平均值±SE（与LPS相比；*，第页< 0.001,n个= 6).
图8
图8
酒精根据暴露时间的长短改变IRAK-M，以不同方式调节人类单核细胞中的LPS信号。急性酒精暴露诱导而慢性酒精降低人单核细胞中的IRAK-M，从而降低或增加下游LPS信号分子IRAK-1、IKK、ERK和NF的活性κB、 最后是TNF-α生产。
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