Secreted versus membrane-anchored collagenases: relative roles in fibroblast-dependent collagenolysis and invasion

doi:10.1074/jbc.M109.002808

.2009年8月21日；284(34):23001-11.

doi:10.1074/jbc。M109.002808。 Epub 2009年6月19日。

分泌型胶原酶与膜锚定型胶原酶在成纤维细胞依赖性胶原酶溶解和侵袭中的相对作用

法里德·萨贝赫¹, 李晓燕, 托马斯·桑德斯, R格兰特·罗, 史蒂芬·J·维斯

附属公司

PMID： 19542530
预防性维修识别码： PMC2755707型
内政部： 10.1074/jbc。M109.002808

分泌型胶原酶与膜锚定型胶原酶在成纤维细胞依赖性胶原酶溶解和侵袭中的相对作用

法里德·萨贝赫等人。生物化学杂志. 2009.

.2009年8月21日；284(34):23001-11.

doi:10.1074/jbc。M109.002808。 Epub 2009年6月19日。

作者

法里德·萨贝赫¹, 李晓燕, 托马斯·桑德斯, R格兰特·罗, 史蒂芬·J·维斯

附属

¹密歇根大学内科分子医学和遗传学系，美国密歇根州安娜堡48109。

PMID： 19542530
预防性维修识别码： PMC2755707型
内政部： 10.1074/jbc。2009年2月808日

摘要

成纤维细胞在从大块组织吸收到通过三维细胞外基质入侵的过程中降解I型胶原，I型胶原是哺乳动物中发现的主要细胞外蛋白。目前的证据表明，I型胶原酶溶解是由基质金属蛋白酶（MMP）基因家族的分泌成员和膜锚定成员介导的。然而，在成纤维细胞介导的基质重塑过程中，这些多重且可能冗余的降解系统所起的作用尚不明确。在此，我们使用从Mmp13（-/-）、Mmp8（-/-]）、Mmp 2（-/--）、Mm p9（-/－）、Mmb14（-/---）和Mmp16（-/----）小鼠分离的成纤维细胞来定义分泌型和膜锚定型胶原酶在胶原蛋白再吸收与胶原蛋白侵袭事件中的功能作用。在存在功能性纤溶酶原激活物-纤溶酶原轴的情况下，分泌的胶原酶臂细胞具有多余的胶原酶溶解潜能，使MMP-13、MMP-8、MMP-2或MMP-9单一缺陷的成纤维细胞与野生型成纤维细胞相比，继续降解胶原蛋白。同样，在纤溶酶原存在的情况下，Mmp14（-/-）或Mmp16（-/--）成纤维细胞通过动员分泌的胶原酶保持接近正常的胶原酶溶解活性，但只有Mmp14在支持成纤维细胞侵袭活性的胶原酶溶解过程中发挥必要的作用。此外，通过人工将分泌的胶原酶栓接到Mmp14（-/-）成纤维细胞表面，我们证明了局部细胞周胶原酶溶解活性将胶原蛋白侵袭表型与大块胶原蛋白降解区分开来。因此，尽管分泌型胶原酶臂成纤维细胞具有强大的基质再吸收活性，但只有MT1-MMP具有支持组织无创表型所需的局部胶原酶溶解活性。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**小鼠皮肤成纤维细胞的纤溶酶依赖性和独立性胶原酶溶解活性。** A类和B类考马斯染色法评估在存在或不存在纤溶酶原的情况下，接种在I型胶原凝胶上的小鼠皮肤成纤维细胞对胶原的降解(A类)或羟脯氨酸释放(B类). 在考马斯试验中，在每个孔的中心建立成纤维细胞岛，并将细胞单独孵育，与PDGF-BB一起孵育，或在E-64d（100μ米)、胃蛋白酶抑制素A（50μ米)抑肽酶（20μg/ml）或BB-94（5μ米)在无血清培养基中培养5天(酒吧=20毫米）。在没有或存在抑制剂的情况下，在没有或有PDGF-BB的相同条件下监测羟脯氨酸的释放。结果显示为四个实验的平均值±S.E。C胶原凝胶上培养的成纤维细胞岛在无血清条件下，在不存在或存在纤溶酶原、PDGF-BB和/或BB-94的情况下培养5天，甲苯胺蓝染色(酒吧=20毫米）。D类RT-PCR分析在不含或含有纤溶酶原的情况下，在含有PDGF-BB的I型胶原凝胶上培养48小时的小鼠皮肤成纤维细胞的I型胶原酶和Timp2 mRNA表达。*GAPDH公司*，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

**图2。**
**MT1-MMP在纤溶酶原诱导的依赖性环境中介导胶原蛋白降解。** A类和B类，从野生型或Mmp13分离的原代小鼠皮肤成纤维细胞的胶原酶溶解活性^−/−，百万8^−/−，百万2^−/−，百万9^−/−，毫米14^−/−，毫米16^−/−，或时间2^−/−在I型胶原凝胶上培养5天后，通过考马斯染色对小鼠进行评估(A类)或羟脯氨酸释放(B类). 在考马斯试验中，成纤维细胞介导的下层胶原溶解仅限于MT1-MMP，并被BB-94（5μ米)或TIMP-2（2.5μg/ml），但不是通过TIMP-1（7.5μg/ml）(酒吧=10毫米）。在没有或存在TIMP-2的情况下，在没有或有PDGF-BB的相同条件下监测羟脯氨酸的释放。结果显示为四个实验的平均值±S.E。

**图3。**
**纤溶酶依赖性胶原蛋白降解。** A类在纤溶酶原（20μg/ml）单独存在或与纤溶酶酶原和BB-94、TIMP-1、TIMP-2或抑肽酶共同存在的情况下，评估PDGF-BB刺激的野生型或无效成纤维细胞接种在I型胶原凝胶上的胶原蛋白溶解活性。在5天的培养期后，考马斯染色后可观察到胶原溶解活性区(酒吧=10毫米）。B类在不含抑肽酶或TIMP-2的情况下，测定PDGF-BB刺激的野生型或无效型成纤维细胞在I型胶原凝胶上培养时释放的羟脯氨酸。结果表示为平均值±S.E(n个= 4).

**图4。**
**MT1-MMP调节胶原蛋白侵袭活性。** A类，毫米14^+/+或Mmp14^−/−在Transwell培养皿中，将成纤维细胞培养在I型胶原凝胶的顶部，在无血清培养基中单独培养或在添加纤溶酶原（20μg/ml）的无血清培养液中培养，并通过向Transwell皿的下腔添加PDGF-BB来启动侵袭。Mmp14入侵的典型例子^+/+或Mmp14^−/−苏木精和伊红染色的横截面显示成纤维细胞(A类,酒吧，100微米；这个*双头箭头*横截面标记了胶原蛋白凝胶的边界，而*黑色箭头*显示侵袭细胞）或在培养5天后通过透射电镜进行评估(B类). 14毫米^+/+以及Mmp14^−/−在含有纤溶酶原的培养基中，成纤维细胞被胶原溶解带包围(*黑色箭头*)，但与野生型细胞相比，MT1 MMP缺乏^−/−成纤维细胞不能侵入下层基质(酒吧，10μm）。C在5天的培养期内，用TIMP-1对单独或不存在纤溶酶原或存在纤溶酶原时羟脯氨酸的释放和侵袭细胞的数量进行定量。在进行的3个代表性实验中，在10个随机选择的区域中测定入侵细胞的数量，并回收上清液以释放羟脯氨酸（平均值±S.E。，n个= 3).

**图5。**
**Mmp14中的缺陷^−/−真皮成纤维细胞的功能仅限于胶原侵袭表型。** A类，毫米14^+/+，毫米14^−/−，或Mmp14^−/−用对照或MT1-MMP、MT1-MMP转导的成纤维细胞_E→A，MT1-MMP_ΔCT，MT1-MMP_ΔHPX，MT1-MMP_{MMP-1CAT（基质金属蛋白酶-1CAT）}，或MT1-MMP_{MMP-1CAT/ΔHPX}逆转录病毒载体接种在胶原凝胶上，作为每个孔中心的岛状物，在10%FCS存在下监测72小时的迁移。72小时后，用甲苯胺蓝染色细胞，并在5个随机选择的区域测量细胞前沿迁移的距离(酒吧=5毫米）。显示了三个实验的结果（平均值±S.E.）。B类，Mmp14的增殖活性^+/+或Mmp14^−/−皮肤成纤维细胞在0.5%FCS（对照）、0.5%FCS和成纤维细胞生长因子-2（10 ng/ml）或10%FCS存在下通过BrdUrd摄取量进行测量，如“实验程序”所述(绿色)细胞内碘化丙啶双重染色(红色)由标记*白色箭头*(酒吧，50μm），并在进行的3个代表性实验中，在5个随机选择的字段中量化为平均值±S.E。C和D类，Mmp14的侵袭活性^+/+或Mmp14^−/−酸提取的交联I型胶原中的皮肤成纤维细胞与胃蛋白酶提取的非交联I型胶原蛋白凝胶。14毫米^+/+，毫米14^−/−，或Mmp14^−/−MT1-MMP转导的皮肤成纤维细胞_E→A，MT1-MMP_ΔCT，MT1-MMP_ΔHPX，MT1-MMP_{MMP-1CAT（基质金属蛋白酶-1CAT）}，或MT1-MMP_{MMP-1CAT/ΔHPX}逆转录病毒载体接种在10%FCS存在下的酸或胃蛋白酶提取的胶原蛋白凝胶上，并用PDGF-BB刺激培养5天。在一个由3个代表性实验组成的单一实验中，在10个随机选择的区域中测定入侵细胞的数量(C). 如苏木精和伊红染色的横截面所示，Mmp14的侵袭无效表型^−/−用MT1-MMP或MT1-MMPs转导后，酸提取胶原上培养的成纤维细胞被逆转_{MMP-1CAT（基质金属蛋白酶-1CAT）}但不是MT1-MMP_E→A逆转录病毒表达载体(酒吧=100μm）。这个*双头箭头*标记胶原蛋白凝胶的边界，而*黑色箭头*标记应用于基质表面的成纤维细胞的覆盖层。

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