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.2009年7月7日；106(27):11131-6.
doi:10.1073/pnas.0812789106。 Epub 2009年6月18日。

内源性大麻素系统和CB2受体在小鼠精子发生中的关键作用

保拉·格里马尔迪 1, 奥兰多皮耶朗基罗, 萨拉·迪锡耶纳, 弗朗西斯卡·洛利卡托, Stefania Petrosino公司, 蒂齐亚娜·比萨诺, 拉斐尔热病, 卢西亚诺·德·彼得罗切利斯, 文森佐·迪·马尔佐
附属公司

内源性大麻素系统和CB2受体在小鼠精子发生中的关键作用

保拉·格里马尔迪等。 美国国家科学院程序. .

摘要

内源性大麻素系统（ECS）在精子发生过程中的确切作用尚未阐明。我们使用代表精子发生所有阶段的纯化生殖细胞组分和精原细胞原代培养物。这种方法可以精确定量大麻素受体配体、anandamide和2-花生酰甘油，以及它们的代谢酶和受体在转录和转导水平上的表达。我们的数据表明，雄性小鼠生殖细胞拥有一个活跃而完整的ECS，在减数分裂过程中受到调节，并表明在精子发生过程中存在自分泌内源性大麻素信号。有丝分裂细胞具有较高水平的2-花生酰甘油，这会降低精母细胞和精子细胞的含量。因此，与减数分裂细胞和减数分裂后细胞相比，精原细胞分别表达较高和较低水平的2-轴酰甘油生物合成和降解酶。这种内源性大麻素可能通过激活CB（2）受体在促进生殖细胞减数分裂进程中发挥关键作用。事实上，我们发现选择性CB（2）受体激动剂JWH133可诱导精原细胞中Erk 1/2 MAPK磷酸化级联反应，并促进其向减数分裂方向发展，因为它增加了SCP3阳性细胞的数量，SCP3是减数分裂前期的标志物，并增加了减数分裂早期基因的表达。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
CB（断路器）1，CB2以及有丝分裂、减数分裂和减数分裂后雄性小鼠生殖细胞中TRPV1 mRNA的水平。qRT-PCR按照方法使用减数分裂前（SPG）、减数分裂（SPC）和减数分裂后（SPT）生殖细胞的浓缩组分(A类)和支持细胞（SRT）。SPG中的表达水平，即参考条件（*），被视为所有靶点的1。对于CB1（阴影条）、CB2（灰色条）和TRPV1（黑色条），参考条件的阈值周期平均值分别为28.9、27.2和28.5。通过iQ5实时PCR的基因表达模块计算标准偏差。所有差异均显著(P（P）<0.05），根据Pfaffl等人（40）进行评估。典型实验（R.I.N.>8.5，见方法)如图所示。
图2。
图2。
CB（断路器）2分化雄性生殖细胞的免疫荧光染色。CB的免疫荧光染色2受体（红色信号）、Hoechst核染色（蓝色信号）和不同分化阶段分离睾丸生殖细胞的合并图像。(A类)CB的免疫检测2精原细胞受体(顶部)，粗线期精母细胞(中部)圆形（r-spt）和细长（e-spt）精子细胞(底部). 请注意，免疫荧光也定位于仅含细胞质的血管，细胞质在精子发生过程中从细胞中释放出来（残体，rb）；(B类)CB的高度放大2精原细胞分裂和相互连接的免疫荧光模式。
图3。
图3。
MAPK信号由CB激活2精原细胞中的选择性激动剂JWH133。(A类)JWH133对小鼠精原细胞ERK磷酸化的剂量依赖性激活。将分离的小鼠精原细胞与10−8–5 × 10−6M JWH133在37°C下保持15分钟。培养结束时，制备细胞提取物，并按照方法(B类)精原细胞中JWH133刺激ERK磷酸化的时间-过程分析。分离的精原细胞与10−6M JWH133，在37°C下保持0–60分钟。培养结束时，制备细胞提取物，用抗磷酸化ERK抗体进行Western blot分析。磷ERK的密度分析如所示赖特(C类)用CB处理分离的精原细胞2-选择性激动剂JWH133或CB1-选择性激动剂ACEA或c-套件配体（KL）作为阳性对照，并评估pERKs的激活。密度分析如所示赖特(D类)与CB预孵育（15分钟）的效果2-在不同时间（5min～24h）检测选择性拮抗剂AM630（1μM）对小鼠精原细胞JWH133（1μM）ERKs磷酸化的影响。
图4。
图4。
JWH133促进产后7天（dpp）小鼠雄性生殖细胞的分化。(A类)培养24小时后，代表来自7dpp的对照睾丸生殖细胞或JWH133、AM630刺激的细胞或AM630预处理然后用JWH1330处理的细胞中减数分裂SCP3染色的细胞核百分比的直方图。条形代表s.d(B类)在24小时培养的精原细胞中观察到的具有代表性的免疫荧光图像显示，在减数分裂前期的早期精蛋白、精蛋白、合子蛋白和合子-精蛋白阶段，核扩散上有SCP3（绿色）组织。(C类)在来自7dpp的生殖细胞的对照培养物中或在用JWH133处理24小时的细胞中，钩端、合子和合子粗线期细胞核的百分比。条形图表示s.d(D类)qRT-PCR按照方法在JWH133处理的成熟前生殖细胞（JWH133）和未处理的细胞（Ctr）中。对于所有靶标，Ctr中的表达水平，即参考条件（*），被认为是1。参考条件下的阈值周期平均值为25.76、23.21、26.25和29.79（c）-套件（左起第一条）、Stra-8（左起第二条）、DMC-1（左起三条）、Lhx8（左至第四条）和SPO11（左至最后一条）。通过iQ5实时PCR的基因表达模块计算标准偏差。差异（除Spo11靶点外）显著(P（P）<0.05），根据Pfaffl等人（40）进行评估。典型实验（R.I.N.>8.5，见方法)如图所示。
图5。
图5。
在雄性小鼠生殖细胞减数分裂前、减数分裂和减数分裂后，评估AEA和2-AG生物合成相关酶的mRNA水平。如中所述进行qRT-PCR分析方法使用有丝分裂（SPG）、减数分裂（SPC）和减数分裂后（SPT）生殖细胞的浓缩组分。SPG中的表达水平，即参考条件（*），被视为所有靶点的1。DAG-alpha（浅灰色条）、DAG-beta（阴影条）、NAPE-PLD（点画条）和FAAH（黑色条）的参考条件阈值周期平均值分别为25.0、25.6、26.0和25.8(A类)ABHD12（浅灰色条）、ABHD6（中灰色条）和MGLL（黑色条）分别为23.09、24.33和24.32(B类). 通过iQ5实时PCR的基因表达模块计算标准偏差。所有差异均显著(P（P）<0.05），根据Pfaffl等人（40）进行评估。典型实验（R.I.N.>8.5，见方法)如图所示。
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