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.2009年6月15日；185(6):1047-63.
doi:10.1083/jcb.200811099。

线粒体嵴和嵴连接的形成依赖于Fcj1和Sue/g之间的拮抗作用

里贾娜·拉贝尔 1, 文森特·索巴尼耶, 罗兰·舒尔茨, 弗兰克·沃格尔, 纳丁·门德尔, 安德烈亚·瓦西尔杰夫·纽梅耶, 克里斯蒂安·科纳, 拉维·加加西亚, 托马斯·凯尔, 沃尔夫冈·鲍迈斯特, 马雷克·塞尔克拉夫, 沃尔特·诺佩特, 安德烈亚斯·雷切尔
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线粒体嵴和嵴连接的形成依赖于Fcj1和Sue/g之间的拮抗作用

里贾娜·拉贝尔等。 J细胞生物学. .

摘要

嵴连接（CJ）对线粒体的组织和功能很重要，但其形成和结构的分子基础尚不清楚。我们已经鉴定并表征了酵母中的线粒体膜蛋白Fcj1（CJ蛋白1的形成），该蛋白在CJ中特异性富集。缺乏Fcj1的细胞缺乏CJ，在线粒体基质中表现出内膜同心堆积，并显示F（1）F（O）-ATP合成酶（F（1。Fcj1的过度表达导致CJ形成增加，嵴分枝，CJ直径增大，F（1）F（O）超复合物水平降低。F（1）F（O）寡聚体的形成因其亚基e/g（Sue/g）的缺失而受损，导致CJ直径增大，嵴尖端数量减少，并促进嵴分枝。Fcj1和Su e/g基因相互作用。我们提出了一个模型，其中Fcj1和Sue/g之间的拮抗作用局部调节F（1）F（O）寡聚状态，从而控制嵴的膜曲率以生成CJ和嵴尖端。

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数字

图1。
图1。
Fcj1是正常线粒体形态所必需的。（A） 野生型（WT）和Δfcj1表达线粒体靶向GFP的细胞生长在非发酵培养基上，并通过荧光显微镜观察。（B） Fcj1的结构域描述了线粒体靶向序列（MTS）、跨膜段（TM）、螺旋结构域和具有相应氨基酸残基位置的保守C末端结构域（CTD）。（C） 野生型细胞的亚细胞分离：线粒体（Mito）、微粒体（ER）和胞浆。用指示的标记蛋白Tim44（Mito）、Erp1（ER）和Hxk1（Cytosol）通过蛋白质印迹分析等量的蛋白质（50µg）。（D） Fcj1的线粒体下定位。低渗肿胀（SW）产生的野生型线粒体和有丝分裂体用Oxa1特异蛋白水解片段PK.f处理。（E） Fcj1的膜结合。用NaCl或碳酸钠提取野生型线粒体。用所示标记蛋白进行蛋白质印迹分析，加载膜结合（P）和可溶性（S）组分。DLD、，d日-乳酸脱氢酶。（F） Fcj1的同型相互作用。表达His标记（Fcj1-His）的细胞的线粒体6)或Fcj1的TAP标记变体（Fcj1-TAP）或两者均进行TAP亲和层析。用所示抗体进行Western blotting分析总（T；10%）、结合（B；100%）和未结合（UB；10%）材料。使用兔抗Tom40抗体同时检测Tom40和TAP标记的Fcj1。棒材，1µm。
图2。
图2。
Fcj1在CJ富集。（A） 野生型细胞中Fcj1的免疫金标记。（B） 在CM、IBM和OM模型上绘制Fcj1免疫金标记后的金颗粒表示（Vogel等人，2006）。（C和D）IM中蛋白质密度的量化。通过在模型中沿IM自下而上移动硅片中的滑动窗口来确定距离IM 14nm范围内的金粒子数量（来自C和Vogel等人[2006]的原始数据）。灰色方框表示CJ区域。Fcj1、Cox2（C）和Su的蛋白质密度克和Sue（电子）（D） 如图所示。棒材，100 nm。
图3。
图3。
嵴形态改变，缺乏Fcj1的细胞中没有CJ。化学固定酵母细胞的（A–D）EM层析图。（A） 野生型细胞中线粒体的单层层析图。（B） A.（C）的表面透视图Δfcj1单元格。（D） C的表面重渲染视图。显示OM（蓝色）和IM（黄色）。WT，野生型。棒材，100 nm。
图4。
图4。
Δfcj1线粒体包含典型的F低聚物拉链状结构1F类O（运行）–ATP合成酶。分离线粒体的冷冻电镜层析图。（A）对玻璃化野生型线粒体的层析图进行切片。（B） 图中显示了与A中的方框区域相对应的CJ放大（左）和表面渲染（右）。经Zick等人（2009）许可，重印了面板A和B生物化学与生物物理学报（C–G）Δfcj1线粒体。（C）玻化切片Δfcj1线粒体。（D） C中方框区域的放大图（左）和表面渲染图（右）显示了具有F特征的拉链状规则排列1F的零件1F类O（运行）–ATP合成酶。IM显示为黄色，F1F类O（运行）–ATP合酶显示为红色。（E）10 nm厚的断层图像切片，穿过典型的F1F的零件1F类O（运行）–侧视图（箭头）和顶视图（方框区域）中的ATP合成酶。（F和G）通过断层扫描图的截面图和假定F的体积投影俯视图1F类O（运行）–显示了排列在双排六角条纹（F）和双排方形条纹（G）中的ATP合成酶。棒材：（A–C和E）100 nm；（D、F和G）50纳米。
图5。
图5。
观察到的拉链状结构Δfcj1线粒体依赖于二聚体特异性Su的存在e（电子）和Su克第页，共F页1F类O（运行）–ATP合成酶。所示菌株分离线粒体的冷冻电镜层析图。（A） 推定F的俯视图1F类O（运行）–ATP合成酶Δfcj1/Δsug线粒体（左）和表面呈现的表现（右）如图所示。（B） 推定F的俯视图1F类O（运行）–ATP合成酶Δfcj1线粒体（左侧；图4E中方框区域的放大视图）和表面呈现的表示（右侧）如图所示。（C） F的频率分布1–F1距离。F的中心到中心的距离1对所示菌株的分离线粒体进行低温电子显微镜断层扫描，确定其最近邻的粒子(n个=102（对于两个菌株）。棒材，50 nm。
图6。
图6。
Fcj1直接参与确定CJ的数量和架构。（A） 过表达Fcj1的化学固定细胞切片中线粒体的电子显微照片。（B） 含空pCM189质粒的野生型（WT）对照菌株（W303）CJs直径分布(n个=21）和含有pCM189-Fcj1质粒（Fcj1↑；n个= 40). 细胞生长在不可发酵的选择性最低培养基上。绘制了两个菌株在指定范围内直径数的直方图。（C和D）Fcj1在Δfcj1添加强力霉素后不同时间携带pCM189-Fcj1的菌株。使用B中的野生型控制。（C） 通过Western blot分析监测Fcj1的表达水平。（D） Fcj1下调的表型分析。每个线粒体切片的CJ和分支数量（m0小时= 26; 米13.5小时= 69; 米23小时= 49; 米37.5小时= 66; 米47.5小时=57）是在指示的下调时间段（m=线粒体切片数）后，通过化学固定的整个细胞的电子显微照片确定的。Fcj1（0 h）下调前，每个线粒体切片的CJ和嵴分枝数定义为100%。rho的数量0/ρ−细胞和包含嵴堆积的细胞与每个时间点的总细胞数有关。
图7。
图7。
Fcj1降低了F的稳定性1F类O（运行）–ATP合成酶低聚物。（A） 野生型（WT）中的蛋白质水平，Δfcj1， Δsue、和Δsug线粒体。将等分样品进行SDS-PAGE，并用所示抗体进行修饰。（B） F的溶解度1F类O（运行）–洗涤剂中的ATP合成酶。Fcj1-过表达（Fcj1↑）、野生型和Δfcj1将菌株溶解在洋地黄素中并离心以获得上清液（S1）和沉淀（P1）级分。用Triton X-100处理未溶解材料（P1）并离心，以获得上清液（S2）和颗粒（P2）组分。用所示抗体通过Western blotting分析等分样品。（C） BN-PAGE分析。野生型，Δfcj1和Fcj1-过度表达的线粒体（400µg）以指示的洋地黄苷元/蛋白质比率（Dig/Prot；wt/wt）溶解，并进行BN-PAGE和F凝胶分析1F类O（运行）–ATP酶活性。所有通道都来自相同图像设置下的单个凝胶，但通道8和通道9是按照适当的顺序剪切和粘贴的，以保持清晰。（D） SEC.野生型，Δfcj1和Fcj1-过表达线粒体以1（wt/wt）的洋地黄苷/蛋白质比率溶解，并通过Superose 6凝胶过滤色谱进行分离，通过Western blotting分析等分样品。F的低聚物形式1F类O（运行）–ATP合成酶（O，低聚物；T，四聚物；D，二聚体；M，单体）表示为尺寸标记。
图8。
图8。
Fcj1和F之间的功能链接1F类O（运行）–ATP合成酶。（A和B）Fcj1与Su的遗传互作e（电子）和Su克（A）指示菌株（BY4742）在30°C下指数生长期间在完全液体乳酸培养基中生长的产生时间(n个= 4). 误差条显示标准偏差。根据t吨指示测试。（B） 通过在可发酵（酵母蛋白胨葡萄糖[YPD]）和呼吸（乳酸培养基[YLac]）碳源上以1:10的步骤滴稀释测试指示菌株的生长。（C和D）化学固定的线粒体的电子显微照片Δsug（C） 以及Δsue（D） 单元格。分支用箭头表示。所示方框的放大显示为野生型（WT；m=40）线粒体切片电子显微照片中CJ的C（E）直径的插图，以及Δsue菌株（m=40；m=线粒体切片数量）。显示了所示范围内观察到的直径数量的柱状图。棒材，100 nm。
图9。
图9。
线粒体嵴和CJ形成的工作模式。（A） CM不同区域的膜曲率以及Fcj1和Su的亚软骨定位示意图e（电子）和Su克在野生型线粒体中。阳性膜弯曲用蓝色表示，阴性弯曲用红色表示，两种或无明显弯曲的区域用紫色表示。侧视图（左侧）或旋转90°后的横截面（中间）显示了带有一个CJ的代表性嵴板的概览。3D视图中方框区域的放大显示了Fcj1，Su的拟议布置e（电子）/苏克F的、和1F类O（运行）CM的各个区域及其对膜曲率的影响。（B） 在所示突变线粒体中观察到的CM结构中膜曲率的示意图。当Fcj1耗尽时，CM的正曲率占主导地位，而需要膜负弯曲的膜结构则不存在。苏的缺乏e（电子）/苏克导致阳性膜曲率明显降低，导致CJ直径增大，嵴分支，表观嵴尖端数量显著减少。Fcj1水平增加产生类似的表型。然而，此突变体不影响嵴尖端的形成。ICS，晶内间隙；M、 矩阵空间。
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