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.2009年9月15日；392(2):133-8.
doi:10.1016/j.ab.2009.05.046。 Epub 2009年6月2日。

测定分离酶活性的荧光分析法的开发和验证

迪潘詹·巴苏 1, 张能刚, 阿尼尔·K·帕尼格拉希, 特尔扎·霍顿, 黛巴南达·帕蒂
附属公司

测定分离酶活性的荧光分析法的开发和验证

迪潘詹·巴苏等人。 Ana Biochem公司. .

摘要

Separase是一种内肽酶，通过裂解其底物凝集素Rad21在后期姐妹染色单体的分离中起着关键作用。最近的研究表明，分离酶是一种致癌基因。过表达separase诱导小鼠非整倍体和乳腺肿瘤发生。Separase在包括乳腺癌、前列腺癌和骨肉瘤在内的多种人类癌症中也过度表达和定位错误。目前，还没有定量测定分离酶活性的方法。为了量化分离酶的活性，我们设计了一种以7-氨基-4-甲基香豆素酸（AMC）结合的Rad21有丝分裂位点肽（Ac-Asp-Arg-Glu-Ile-Nle-Arg-MCA）作为分离酶底物的荧光分析方法。我们使用该分析来量化细胞周期进展期间以及在一组人类肿瘤细胞系和白血病患者样本中的分离酶活性。

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图1
图1
分离和激活Separase。分离酶从293T免疫沉淀并用爪蟾鸡蛋提取物。（A-B）。活性Separase蛋白浓度的估算。5、10和15μl（相当于3.8、7.6和11.4μg输入蛋白）的活化Separase制剂在7%的SDS-PAGE上进行解析。用考马斯染色法观察蛋白质条带（A），并在免疫印迹法上用抗Separase mAb探测Separase条带（B）。使用Imagequant软件定量考马斯凝胶上全长和高压发酵分离酶带与总带强度。活化的Separase蛋白浓度计算为Separase-条带光密度与考马斯凝胶总条带强度的比值，估计为～33.5ng/μl。（C） ●●●●。使用活化Separase进行Rad21裂解分析的免疫印迹。该分析在37°C下进行1h。蛋白质在8%SDS-PAGE上得到了解析。用抗Rad21单克隆抗体观察全长Rad21和裂解片段（箭头）。
图2
图2
Separase分析的发展。（A） ●●●●。体外测定活化Separase的荧光分析概述。用活化Separase裂解Rad21肽基MCA，用荧光发射法测定裂解产物的量。（B） ●●●●。增加活化的分离酶浓度对AMC释放的影响。在没有酶的情况下，仅在底物存在的情况下对非特异性背景测量进行校正后得到的结果作为相对荧光单位。根据每小时每纳米基质释放的纳米AMC（Rad21肽基-MCA）计算活性。◆ = 激活的分离酶，▪ = 未激活的分离酶。每个数据点是三个观测值的±SEM。（C） ●●●●。在4、23、30、37和55°C下，经活化的Separase酶裂解Rad21-肽基MCA后AMC释放的时间和温度依赖性。在不同温度条件下，在活性Separase酶存在下培养16.75ng活性酶和2纳米Rad21肽基MCA，培养时间为9h。校正无酶条件下测得的非特异性背景后，结果以指示时间点的相对荧光单位表示。数值为3个观测值的平均值+/-SE。（D） ●●●●。被激活的Separase酶切割Rad21肽基MCA后的AMC释放是pH的函数。值是3次观察的平均值+/-SE。
图3
图3
分离酶动力学的表征。（A） ●●●●。在37°C下，在Rad21-肽基MCA（50-1600μM）和活化的Separase酶（33.5ng/μl）浓度增加的情况下进行3小时的裂解反应。结果表示为在不存在酶的情况下测量的非特异性背景校正后的纳摩尔AMC释放/hr。饱和动力学绘制为Michaelis-Menten曲线。（B） ●●●●。V（V）最大值和KM（M）使用Lineweaver-Burk图进行计算。
图4
图4
细胞和白血病样本中分离酶活性的测定。（A） ●●●●。有丝分裂过程中的分离酶活性。HeLa细胞用双胸腺嘧啶核苷同步化，并用诺卡唑阻滞于G2/M。在诺卡唑释放后0、60、80、100、120和140分钟，收集中期阻滞细胞进行裂解。用每个时间点的20μg蛋白质进行分离酶活性测定。每个时间点是三个观测值的平均值±SEM。（B） ●●●●。诺康唑释放后HeLa细胞中细胞周期蛋白B和Securin水平的免疫印迹。（C） ●●●●。在一组白血病细胞系中进行分离酶活性测定。分析每个品系20μg总蛋白。（D） ●●●●。儿童AML样本中的分离酶活性。正常人外周血细胞作为对照。分析每个样品25μg总蛋白。
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