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.2009年6月26日；284(26):17648-56.
doi:10.1074/jbc。M902005200。 Epub 2009年4月29日。

蛋白激酶Calpha磷酸化α6-微管蛋白激活人乳腺细胞运动

Thushara P Abeyweera公司 1, 陈香玉, 苏珊·罗滕伯格
附属公司

蛋白激酶Calpha磷酸化α6-微管蛋白激活人乳腺细胞运动

Thushara P Abeyweera公司等。 生物化学杂志. .

摘要

先前研究表明，蛋白激酶Calpha（PKCalpha）的工程过表达可赋予非运动MCF-10A人类乳腺细胞积极的运动能力。PKCalpha的一个可追踪突变（Abeyweera，T.P.和Rotenberg，S.A.（2007）《生物化学》46，2364-2370）表明，α6-微管蛋白在表达可追踪PKCalpha的细胞中被磷酸化，在体外被野生型PKCalpha.磷酸化。功能获得，在α6微管蛋白（Ser158、Ser165、Ser241和Thr337）的每个PKC共有位点构建单位点突变（Ser->Asp），以模拟磷酸化。在MCF-10A细胞中表达每个结构后，运动分析确定Ser165是α6-微管蛋白中唯一的位点，其假磷酸化再现了PKCalpha产生的运动行为。磷酸化抗性突变体（S165N-alpha6-tubulin）的表达导致通过表达PKCalpha或通过PKCalpha-选择性激活剂二酰甘油内酯治疗刺激的MCF-10A细胞运动受到抑制。用二酰甘油-内酯处理的MCF-10A细胞显示内源性α-微管蛋白的强烈磷酸化，当S165N-α6-微管蛋白表达时，这种磷酸化可以被阻断。S165N突变株还抑制了内源性高PKCalpha水平表达或缺乏PKCalpha和其他传统亚型（MDA-MB-468细胞）的固有运动型人类乳腺癌细胞。比较MDA-MB-468细胞中表达的Myc-tagged野生型α6-微管蛋白和S165N-alpha6-tubulin，发现Ser165也是内源性活性非传统PKC亚型的主要磷酸化位点。PKC刺激的MCF-10A细胞运动对诺卡唑敏感，因此在该机制中涉及微管伸长。这些发现支持了一种模型，在该模型中，PKC在Ser165磷酸化α-微管蛋白，导致微管伸长和运动。

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数字

图1。
图1。
体外α6微管蛋白的胞内磷酸化。 一个在50μg的存在下，通过重组GST-PKCα（1μg）直接磷酸化重组75-kDa GST-α6-微管蛋白米[γ-32P] ATP+激活器（0.5 m米钙2+，磷脂酰丝氨酸（0.1 mg/ml）），在30°C下放置30分钟，如“方法”所述。产物用6%SDS-PAGE溶解，然后用凝胶蓝染色，并在−20°C下放射自显影2天。结果代表了三个独立的实验。B类渗透性MCF-10A转染剂中α-微管蛋白的细胞内磷酸化。收集转染M417A-PKCα或VC的细胞，在低渗、无洗涤剂缓冲液（20 m）中溶解米Tris，pH 7.4，2 m米EGTA，2米米氯化镁2，1米米二硫代苏糖醇），用皂苷（50μg/ml）渗透，并用100μ米[γ-32P]（P）N个6-苯-ATP，如“方法”所述。用抗α-微管蛋白免疫沉淀细胞裂解物，并在−20°C下用8%SDS-PAGE和放射自显影术分析免疫球蛋白1周。实验进行了两次，结果相似。
图2。
图2。
GFP-α6-微管蛋白假磷酸化突变体对MCF-10A细胞运动性的影响。 一个用α-微管蛋白单克隆抗体通过Western blot分析表达重组WT-GFP-α6-微管蛋白、假磷酸化GFP突变体（S165D、S158D、S241D或T337D）或VC的MCF-10A转染体（25μg/lane）的裂解产物，以检测GFP融合蛋白（75 kDa）和内源性α-微管蛋白（50 kDa。注意，为了进行比较，包括了抗磷酸化突变体S165N。结果在三个独立的实验中观察到。B类用转染GFP-α6-微管蛋白、WT-PKCα的单位点假磷酸化突变体或载体对照的MCF-10A细胞进行运动测定。每个值是三次测量的平均值±S.D.。结果代表三次独立实验。
图3。
图3。
抗磷酸化α6-微管蛋白突变体（S165N）抑制MCF-10A细胞的运动并降低内源性α-微管蛋白的磷酸化。 一个，S165N-α6-微管蛋白抑制刺激的MCF-10A细胞的运动行为。在S165N突变体（GFP-（S165N）-α6-微管蛋白）表达后，检测细胞是否对WT-PKCα过度表达或用5μ米DAG-内酯用于实验期间。比较S165N突变体和PKCα激酶缺陷突变体阻碍运动的能力(杜兰特). 所有转染均使用等量的质粒DNA（4μg）。B类，S165N-α6-微管蛋白抑制MCF-10A细胞中DAG-内酯刺激的内源性α-微管蛋白磷酸化。用4μg S165N突变体或VC转染细胞米裂解前，DAG内酯或二甲基亚砜（0.1%，v/v）在37°C下保存30分钟。在0.2 ml微管稳定萃取缓冲液（0.1）中制备裂解液米管道，pH 6.9，30%甘油，5%二甲基亚砜，1 m米硫酸镁4，1米米含蛋白酶抑制剂和10μ米BIM。从裂解液中制备含有未结合微管蛋白的可溶性部分（见“材料和方法”），并对总蛋白含量（280μg）进行归一化，用放射免疫沉淀缓冲液将每个样品体积调节为1.0 ml。样品用小鼠IgG-琼脂糖预处理，并用2μg小鼠抗α-微管蛋白免疫沉淀15 h，在4°C下旋转。免疫球蛋白被分成重复的印迹，并与兔多克隆磷酸化PKC底物抗体（1:500稀释）或兔抗α-微管蛋白（1:2500稀释）平行检测。结果代表了三个独立的实验。
图4。
图4。
抗磷酸化α6-微管蛋白突变体（S165N）抑制人类乳腺癌细胞的运动。 一个GFP-（S165N）-α6-微管蛋白（4μg质粒）在表达非常高水平PKCα（MDA-MB-231）或完全不表达PKCα的人乳腺癌细胞系（MDA-MB-468）中表达后，对运动的主要负作用。每个值是三次测量的平均值±S.D.，结果代表三次独立实验。P（P），亲代细胞。B类，MDA-MB-468细胞中Myc-taggedα6-微管蛋白报告子构建的磷酸化。用4μg编码Myc标记的WTα6-微管蛋白、S165N突变体或VC的质粒转染细胞48小时米BIM或DMSO（0.1%，v/v），并在细胞裂解前在37°C下培养30分钟。在含有50 m的0.2 ml缓冲液中制备全细胞裂解物米三氯化氢，pH 7.4，150 m米氯化钠，1米米EGTA，10μ米BIM和0.5%的Nonidet P-40。将总蛋白含量（550μg）归一化后，将裂解液在无洗涤剂缓冲液中稀释5倍，然后用小鼠IgG-琼脂糖进行预处理，并用5μg小鼠抗Myc抗体进行免疫沉淀（旋转6小时，4°C）。在Western blot中检测到Myc-taggedα6-微管蛋白（50kDa带），用兔抗磷-PKC底物（1:500）和兔抗Myc底物（1:1000）依次探测。结果代表了三个独立的实验。
图5。
图5。
诺康唑治疗可消除PKCα或S165D-α6-微管蛋白产生的MCF-10A细胞的运动性。用4μg编码PKCα、S165D-α6-微管蛋白或载体对照的质粒DNA转染细胞，如“材料和方法”所述。48小时后，将细胞接种到10孔载玻片上，然后在37°C和5%CO下培养2隔夜，细胞被处理(t吨=0），5μ米诺卡唑（或0.1%（v/v）DMSO），并在8小时后分析运动性。每次测量是三次测量的平均值±S.D.，结果代表三次独立实验的结果。
图6。
图6。
组装微管蛋白异二聚体的结构模型。模型显示Ser165(绿色)α-微管蛋白亚基(蓝色)位于两个聚合的α/β-异二聚体的界面。序号165参与与生长聚合物正端的β-微管蛋白亚基的纵向接触，并可能影响GTP水解或GDP/GTP在β-微管蛋白上的交换。指出了β-微管蛋白的可交换GTP/GDP和α-微管蛋白质的不可交换GTP。突出显示的在里面棕色的是由Cdk1（Ser）磷酸化的β-微管蛋白中的位点174（33）。使用2.80版的Protein Explorer对α/β-异二聚体（蛋白质数据库条目1TUB）进行分子建模。
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