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.2009年5月28日；28(21):2163-72.
doi:10.1038/onc.2009.82。 Epub 2009年4月20日。

非小细胞肺癌中Wnt通路异常包括自分泌Wnt激活的发生频率较高

G阿基里 1, M M切里安, S维贾亚库玛, G刘, 巴菲科, S A Aaronson公司
附属公司

非小细胞肺癌中Wnt通路异常包括自分泌Wnt激活的发生频率较高

G阿基里等。 癌基因. .

摘要

肺癌是全世界癌症死亡的最常见原因。非小细胞肺癌（NSCLCs）约占肺部肿瘤的80%，预后较差，通常对常规化疗无效。阐明非小细胞肺癌中失调的分子和细胞机制可能会为靶向治疗或提高现有治疗的疗效带来新的可能性。在这里，我们通过不同的机制证明了约50%的人类NSCLC细胞系和原发性肿瘤中Wnt通路的激活，包括自分泌Wnt通路激活涉及特定Wnt配体的上调。下调激活的Wnt信号抑制非小细胞肺癌的增殖并诱导更分化的表型。总之，我们的发现确立了激活Wnt信号在人类非小细胞肺癌中的重要性，并提供了靶向上调Wnt信号作为该疾病新治疗方式的可能性。

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利益冲突声明

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
人非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系中Wnt信号的激活。(一)用谷胱甘肽沉淀总细胞裂解物（1 mg）S公司-转移酶（GST）-E钙粘蛋白融合蛋白（Bafico等., 1998). 用针对β-catenin的单克隆抗体对总细胞裂解物（25µg）和GST-E-cadherin沉淀物进行免疫印迹分析。(b条)感染TOP或FOP TCF-GFP报告慢病毒或表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）慢病毒（LV-GFP）的H460（上面板）和H23（下面板）NSCLC细胞的荧光激活细胞分选（FACS）分析、相位对比和荧光图像。BF，亮场；FL，荧光。(c（c）)慢病毒介导的人类非小细胞肺癌细胞TCF-GFP报告活性。结果表示为TOP/FOP-GFP平均荧光强度（MFI）的比值。给出了两个独立实验的结果。
图2
图2
抑制FRP1和DKK1对人非小细胞肺癌（NSCLC）细胞Wnt/β-catenin信号转导和生长的影响。(一)FRP1和DKK1的组成性表达对H1819 NSCLC细胞株中非折叠β-catenin的影响。如材料和方法所述，通过免疫印迹分析测定FRP1和DKK1的表达。(b条)使用血凝素（HA）标记的FRP1（上面板）和标记的DKK1（下面板）的可调节表达分析非融合β-catenin的NSCLC株系。如补充材料和方法中所述，产生表达Tet可调节的FRP1-HA或DKK1-Flag的NSCLC细胞。通过从培养基中去除dox来诱导FRP1-HA或DKK1-Flag的表达。以表达四环素转激活剂（tTa）的细胞作为对照。按照材料和方法中所述，使用1mg总细胞裂解物对未复合的β-连环蛋白进行分析，A427细胞除外，其中使用0.1mg细胞裂解物。如材料和方法所述，通过免疫印迹分析测定FRP1和DKK1的表达。(c（c）)FRP1和DKK1介导对非小细胞肺癌细胞系TCF荧光素酶报告活性的抑制。荧光素酶报告活性通过TOP/RL比值除以FOP/RL比率来计算。将结果归一化为载体转导培养物的结果。这些值表示两个独立实验的平均值±标准差。(d日)实时PCR定量FRP1和DKK1对axin2（轴2）mRNA表达。H23、A1146和H1819细胞被载体（VEC）、FRP1-HA或DKK1-Flag慢病毒感染。按照补充材料和方法进行qRT-PCR。使用ΔΔC（t）方法量化相对mRNA表达水平（Pfaffl，2001）。(e（电子）)DKK1对细胞生长的影响。A549、H23、H1819和A427细胞感染慢病毒表达载体（VEC）或DKK1-Flag和2×104细胞被置于60mm的组织培养皿中。在电镀后2–3周，用结晶紫染色观察培养物。如材料和方法所述，通过免疫印迹分析评估标记DKK1的表达。
图3
图3
Wnt2和Wnt3a的过度表达有助于自分泌型非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中Wnt的结构性激活。(a、 b条)Wnt2的实时PCR定量(一)和Wnt3a(b条)分别在H23和H1819细胞中表达。为了观察Wnt2和Wnt3a的相对表达水平，在饱和前去除qPCR反应，PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上分离并用溴化乙锭染色。(c（c）)Wnt2和Wnt3a的shRNA敲除定量。用表达靶向绿色荧光蛋白（GFP）、Wnt2或Wnt3a的shRNA的慢病毒感染H23和H1819细胞。(d日)shRNA敲除Wnt2和Wnt3a对TCF报告活性的影响。荧光素酶报告酶活性通过TOP/RL比值除以FOP/RL比率来计算。每列代表两个独立实验的平均值±标准差。(e（电子）)shRNA敲除Wnt2和Wnt3a对axin2（轴2）mRNA表达。H23和H1819细胞被表达靶向GFP、Wnt2或Wnt3a的shRNA的慢病毒感染。
图4
图4
诱导型显性阴性TCF-4（DNTCF-4）对非小细胞肺癌（NSCLC）自分泌细胞生长的影响。(一)DNTCFs表达的免疫印迹分析。在四环素诱导启动子的控制下，用表达DNTCF-4（DN）、DN-mOrange（DN-mO）和载体（VEC）的慢病毒感染H23和H1819细胞，并在dox存在下用嘌呤霉素进行筛选。洗涤后，在存在或不存在dox的情况下将细胞分成单独的细胞培养皿，并在诱导后3天通过免疫印迹进行分析。使用TCF-4抗体检测DNTCF-4蛋白的表达。还观察到低分子量免疫反应性DNTCF物种。分子量单位为千道尔顿（kDa）。(b条)DNTCF对axin2（轴2）mRNA表达。从感染的H23和H1819细胞中提取RNA(一)在dox存在或不存在的情况下维持3天。(c（c）)DNTCF对细胞周期的影响。感染H23和H1819细胞的碘化丙啶（PI）分析(一)诱导后3天，在dox存在或不存在的情况下维持。数字表示G中单元格的百分比1或每个分析细胞系的S期。结果代表了至少两个独立的实验。(d日)在诱导后3天观察到在有无dox的情况下对表达可诱导DN-mO的H23细胞增殖的影响。BF，亮场；FL，荧光。(e（电子）)VEC、DN和DN-mO表达后2-3周对H23和H1819生长的影响。总计2×104在dox存在或不存在的情况下，将细胞接种到60mm的平板上。用结晶紫染色观察培养物。(（f）)DNTCFs对c-Myc、cyclin D1和p21表达的影响。用免疫印迹法分析感染VEC、DN和DN-mO的H23和H1819细胞的蛋白裂解物，并在有或无dox的条件下生长3天。强力霉素。
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