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.2009年4月20日；185(2):305-21.
doi:10.1083/jcb.200810098。 Epub 2009年4月13日。

自噬需要早期内吞体和内吞体共变异构体

米努·拉齐 1, Edmond Y W Chan先生, 莎伦·A·图兹
附属公司

自噬需要早期内吞体和内吞体共变异构体

米努·拉齐等。 J细胞生物学. .

摘要

自噬是一种细胞内降解途径，在正常和应激条件下维持细胞内稳态。新生的双膜自噬体隔离并包围细胞溶质成分和细胞器，随后与内质体途径融合，使内容物降解。自噬需要自噬体与晚期内体融合，但与早期内体融合是否必要尚不清楚。我们表明，AVs与功能性早期内体的融合是自噬所必需的。COPI亚单位（β’、β或α）的丢失对早期内吞体功能的抑制会导致自噬体的积累，但不会增加自噬通量。COPI是ER-Golgi转运和早期内体成熟所必需的。虽然COPI的丢失导致高尔基体的断裂，但这并不诱导自噬体的形成。COPI的缺失会导致早期内体功能的缺陷，因为转铁蛋白循环和EGF内化和降解都受到损害，这种功能的缺失会抑制自噬、p62/SQSTM-1的积累以及自噬体内的泛素化蛋白。

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数字

图1。
图1。
COPI的siRNA缺失增加了自噬。（A） 免疫印迹显示，293/GFP-LC3细胞中β′-、β-和α-COPI（顶部）以及Sec23A和B（底部）的siRNA缺失持续48小时。相应亚单位的蛋白质水平降低。（B） β′-、α-和β-COP的缺失，而不是COPII亚基的缺失（第23A和B节）增加了GFP-LC3-II。在A和B中，微管蛋白是负荷控制因素。（C） 在β′-、α-和β-COP的siRNA缺失后，293/GFP-LC3细胞中可检测到GFP-LC3-阳性小泡，但在对照siRNA-缺失细胞中仅观察到基本水平的GFP-LC3-阳性小泡。
图2。
图2。
COPI耗竭的时间过程表明高尔基体在AV形成之前就已经扩散，但高尔基体的扩散并不会导致AV的形成。（A） 293/GFP-LC3细胞中COPI亚基缺失，并在添加siRNA后24、36和48小时进行分析。β′-和α-COP的免疫印迹证实COP亚基缺失。（B） 在指定的时间，使用抗GFP抗体通过平行裂解液中的免疫印迹监测GFP-LC3-I和-II。（C） 在24小时siRNA处理后，β′-COP的缺失导致了GM130的形态变化和核周细胞数量的减少。方框表示放大区域。（D） 使用siRNAs去除Rab1a/b 48小时。用抗Rab1探针检测裂解产物以确认缺失。（E） β′-COP或Rab1a/b像D一样被耗尽，并使用抗GM130和GFP荧光进行间接免疫荧光分析。在β′-COP面板中，星号表示未显示GFP-LC3阳性AVs积聚的细胞。
图3。
图3。
COPI siRNA缺失后的AV形成需要Atg5和Atg7。将293/GGFP-LC3细胞与β′-、α-COP的siRNA或对照siRNA单独孵育48小时，或与针对Atg5或Atg7的siRNA组合孵育48小时，然后（A）裂解并通过免疫印迹分析Atg5、Atg7、GFP-LC3和微管蛋白（负载对照），或（B）使用抗ERGIC-53抗体或GFP荧光固定用于免疫荧光分析。在A中，星号表示非特定带；在B和C中，星号表示没有显示片段ERGIC-53的细胞。
图4。
图4。
GFP-LC3点的相关光电子显微镜分析表明它们是AV。（A） α-COP siRNA缺失48小时后293/GFP-LC3细胞相同场的相、（B）荧光和（C）TEM。在B中，图像被反转，以便更好地显示GFP-LC3阳性结构。（D） A和C中带星号的单元格放大倍率较高。E中感兴趣单元格的顶部区域放大，以显示B中箭头指示的两个AV结构。（F和G）E中箭头显示的AV放大倍率更高。
图5。
图5。
Ub和p62在α和β′-COP缺失的293/GFP-LC3细胞中积聚。（A） 用对照或β′-COP siRNA处理293/GFP-LC3细胞48 h，然后用抗p62和抗泛素抗体固定并标记，与GFP-LC3.共定位。（B） HEK293细胞按A处理，并用抗泛素和抗p62抗体标记。（C） 用抗Ub抗体标记β′-COP缺失细胞的冷冻切片，然后用10-nm蛋白A-金标记。AV，自噬体。
图6。
图6。
COPI耗竭细胞中的AVs是不可降解的。（A） 在293/GFP-LC3细胞中用对照或β′-COP siRNA转染72 h后评估长期蛋白降解。细胞要么缺乏氨基酸2h（St），要么在新鲜生长培养基（Fed）中培养2h。蛋白质降解量表示为平均值±SEM。（B）siControl-处理的细胞和β′-和α-COP耗尽48h，然后在固定前用Lysotracker red（50 nM）培养30min。合并后的图像显示GFP-LC3 AV阳性结构几乎没有共定位。星号表示插图中放大的单元格。（C） β′-和α-COP siRNA缺失后，Magic Red-RR2用（MR）检测喂食或饥饿（St）2h的细胞中的活性组织蛋白酶B。用流式细胞仪测量活细胞中MR标记的强度。
图7。
图7。
GFP-LC3 AV为LAMP2阳性。（A） 293/GFP-LC3细胞与对照或β′-或α-COP siRNA孵育48 h，用抗LAMP2抗体固定并标记，然后用Alexa 555抗小鼠抗体。COPI耗竭后，许多GFP-LC3阳性AV对LAMP2呈阳性。星号表示插图中放大的单元格。（B） 如图所示，用抗GFP（左）或抗GFP和抗LAMP2（右）标记的β′-COP缺失细胞的冷冻切片，然后是蛋白A-金。AV，自噬体，M，线粒体。
图8。
图8。
GFP-LC3阳性AVs在COPI耗竭后共同定位TGN46和早期内吞标记物。（A） 293/GFP-LC3细胞与β′-COP的siRNA或对照siRNA（Cont）孵育48 h，进行免疫荧光处理，并用TGN46抗体标记。在（B）中，siRNA处理的细胞被固定并标记，或饥饿2小时（St），并用EEA1抗体标记。（C） 对照饥饿的HEK293细胞在甲醇固定后通过双重标记标记内源性LC3和EEA1。（D） siRNA处理后，将罗丹明标记的右旋糖酐内化20分钟，然后进行40分钟追踪，然后固定293/GFP-LC3细胞并通过共焦显微镜进行分析。
图9。
图9。
COPI耗竭抑制了转铁蛋白和EGF的贩运。293/GFP-LC3细胞用β′-COP siRNA或对照siRNA处理。48小时后，用Alexa 555转铁蛋白（A）孵育2分钟、（B）30分钟或（C）30分钟，然后进行30分钟追踪，然后清洗、固定并用共聚焦显微镜进行分析。（D和E）125在β′-COP的siRNA缺失48小时后，或控制siRNA 10分钟后，将I-EGF添加到HeLa细胞中。然后按照材料和方法中的描述清洗细胞，并追踪30、60、120和180分钟（包括10分钟培养）。（D） 金额125I-EGF内化量占总量的百分比125I-EGF在10分钟内吸收（E）降解量125I-EGF测定为TCA沉淀后总放射性占总放射性的百分比125I-EGF内部化。实验重复进行三次，所示数据为平均值±SEM。显著性由Student’st吨测试*，P≤0.05。
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