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.2009年4月；20(4):765-76.
doi:10.1681/ASN.2008060566。 Epub 2009年3月18日。

Wnt/beta-catenin信号通路促进肾间质纤维化

何伟春 1, 戴春荪, 李英健, 曾刚, 萨塔珊·蒙加, 刘友华
附属公司

Wnt/beta-catenin信号通路促进肾间质纤维化

何伟春等。 J Am Soc肾病. 2009年4月.

摘要

Wnts组成一个信号蛋白家族，在肾脏发育中发挥重要作用，但其在成人肾脏中的表达被认为是沉默的。在此，我们分析了梗阻性损伤后正常和纤维化肾脏中Wnts及其受体和拮抗剂的表达和调节。在正常小鼠肾脏中，19种不同Wnts和10种卷曲受体基因的绝大多数在不同水平上表达。单侧输尿管梗阻后，除Wnt5b、Wnt8b和Wnt9b外，Wnt家族的所有成员在纤维化肾中均上调，具有明显的动力学特征。此外，还诱导了大多数Fzd受体和Wnt拮抗剂的表达。梗阻性损伤导致肾小管上皮细胞的细胞质和细胞核中β-catenin大量积聚，表明Wnt信号的典型通路被激活。大量Wnt/beta-catenin靶基因（c-Myc、Twist、淋巴增强因子结合因子1和纤维连接蛋白）被诱导，其表达与肾脏β-catenin丰度密切相关。Wnt拮抗剂Dickkopf-1基因的传递显著减少肾脏β-catenin的积累，并抑制Wnt/beta-catenin靶基因的表达。此外，Dickkopf-1基因治疗抑制肌成纤维细胞活化；抑制成纤维细胞特异性蛋白1、I型胶原和纤维连接蛋白的表达；梗阻性肾病模型中总胶原蛋白含量降低。总之，这些结果确立了Wnt/beta-catenin信号通路在肾纤维化发病机制中的作用，并将此途径确定为潜在的治疗靶点。

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数字

图1。
图1。
Wnt基因在正常和纤维化小鼠肾脏中的表达。（A） 典型的RT-PCR结果显示不同Wnt基因在正常小鼠肾脏中的表达。在没有RT的情况下，未检测到PCR产物，表明其特异性。（B） 典型的RT-PCR结果显示，UUO后不同时间点肾脏Wnt mRNA的稳态水平如图所示。数字（1、2和3）表示给定组中的每只动物。（C） 图示显示了纤维化肾脏中Wnt调节的独特动态模式。将损伤后动态模式相似的不同Wnts进行分组。相对mRNA水平的实际值（假对照组的折叠诱导）见补充表1。
图2。
图2。
梗阻性损伤后肾Wnt4和Wnt7a蛋白表达的诱导。在UUO后的不同时间点制备全肾匀浆，并分别用Wnt4、Wnt7a和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体进行免疫印迹。数字（1和2）表示给定组中的每只动物。
图3。
图3。
正常和纤维化肾脏中Fzd受体基因的调节。（A） 代表性的RT-PCR结果显示不同Fzd受体基因在小鼠肾脏中的表达。在没有RT的情况下，未检测到PCR产物，表明其特异性。（B） 典型的RT-PCR结果显示，UUO后不同时间点肾脏Fzd mRNA的稳态水平如图所示。数字（1、2和3）表示每只动物。（C） 图示为纤维化肾脏Fzd调节的动态模式。对损伤后表达模式相似的不同Fzd受体进行分组。相对mRNA水平的实际值（假对照组的折叠诱导）见补充表2。
图4。
图4。
Wnt拮抗剂在梗阻性肾病中的表达。（A） 典型的RT-PCR结果显示了UUO后不同时间点Dickkopf（DKK1至4）mRNA的稳态水平。数字（1、2和3）表示每只动物。（B） 图示为纤维化肾脏中DKK调节的动态模式。将损伤后表达模式相似的DKK进行分组。
图5。
图5。
梗阻性肾病中Wnt/β-catenin典型通路的激活。（A和B）典型的显微照片显示β-catenin在纤维化肾脏中的积聚和定位。对假手术组（A）和UUO组（B）的肾脏进行β-catenin蛋白免疫组化染色。棒材=40μm。箭头表示间质中β-catenin阳性细胞。放大的方框区域中的箭头表示核染色阳性。（C和D）Western blot分析显示梗阻性损伤后肾脏β-catenin丰度显著增加。提供了代表性的蛋白质印迹（C）和定量数据（D）。在GAPDH正常化后，报告了相对β-catenin水平（假对照组的折叠诱导）。数据是每组五只动物的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01对假对照。
图6。
图6。
梗阻性肾病中Wnt/β-catenin靶基因的表达。（A） RT-PCR分析显示，UUO后不同时间点梗阻肾脏中可能存在Wnt/β-catenin靶基因的诱导。（B到D）线性回归显示肾扭转（B）、LEF1（C）和纤维连接蛋白（D）mRNA水平与β-连环蛋白丰度（任意单位）之间密切相关。相关系数(R（右）2)如图所示。（E到H）Western blot分析显示梗阻性损伤后肾脏c-Myc和Twist蛋白丰度显著增加。提供了代表性的蛋白质印迹（E和G）和定量数据（F和H）。GAPDH正常化后，报告相对c-Myc和Twist蛋白水平（假对照组的折叠诱导）。数据是每组五只动物的平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01对假对照。
图7。
图7。
基因治疗后外源性DKK1的表达。（A和B）RT-PCR分析显示外源性DKK1基因在质粒注射后的肝脏（A）和肾脏（B）中表达。注射DKK1质粒后16 h，从肝脏和肾脏中制备总RNA，并进行RT-PCR分析，以检测人DKK1的表达。数字（1、2和3）表示给定组中的每只动物。（C和D）ELISA分析显示，基因传递后，肝脏（C）和肾脏（D）中的DKK1蛋白增加。肝和肾匀浆中的DKK1蛋白水平表示为ng/mg总蛋白*P（P）< 0.05对pcDNA3控件(n个=4至5）。（E） Western blot分析显示肾脏表达外源性DKK1蛋白。肾匀浆分别用抗Flag和抗GAPDH抗体进行免疫印迹。（F） ELISA分析显示，基因传递后循环中DKK1蛋白增加。注射DKK1质粒后16 h从小鼠中采集血浆样本，DKK1蛋白水平以ng/ml表示*P（P）< 0.05对pcDNA3控件(n个= 3).
图8。
图8。
DKK1基因传递阻断梗阻性肾病Wnt/β-catenin信号传导。（A至C）典型的显微照片显示了假小鼠（A）、接受UUO并注射pcDNA3（B）的小鼠和接受UUU并注射pFlag-DKK1质粒（C）的小鼠的肾脏β-catenin的表达和定位。巴=40μm。（D至F）典型的Western blots（D）和定量数据（E和F）表明，DKK1基因的传递降低了梗阻性损伤后肾脏β-catenin和c-Myc的丰度**P（P）< 0.01对假对照；†P（P）< 0.05对pcDNA3型(n个＝4至5）。（G至I）DKK1基因治疗抑制梗阻肾中Twist mRNA（G和H）和蛋白（I）的表达。给出了具有代表性的RT-PCR（G）和Western blot（I）结果和定量数据（H）**P（P）< 0.01对假对照；†P（P）< 0.05对pcDNA3型(n个=4至5）。
图9。
图9。
DKK1阻断Wnt信号传导抑制梗阻肾中α-SMA和FSP-1的表达。（A和B）代表性RT-PCR分析（A）和定量数据（B）显示，DKK1基因的递送抑制了梗阻性损伤后肾脏α-SMA mRNA的表达。（C和D）典型的Western blot（C）和定量数据（D）表明DKK1抑制梗阻性损伤后肾脏α-SMA蛋白的表达。数字（1、2和3）表示给定组中的每只动物。在GAPDH正常化后，分别报告相对α-SMA mRNA（B）或蛋白质（D）水平（假对照组的折叠诱导）**P（P）< 0.01对假对照；†P（P）< 0.05对pcDNA3型(n个=4至5）。（E） 如图所示，典型的显微照片显示不同组的α-SMA蛋白通过免疫荧光染色定位，FSP-1蛋白通过免疫组织化学染色定位。棒材=40μm。（F） 如图所示，定量测定不同组中FSP-1的表达**P（P）< 0.01对假对照；†P（P）< 0.05对pcDNA3型(n个=4至5）。
图10。
图10。
DKK1抑制Wnt信号可减少UUO后肾间质损伤和总胶原沉积。（A至F）肾切片用Picrosius红色（A至C）和Masson三色（D至F）染色，以评估胶原蛋白沉积。所示为不同组的代表性显微照片。（A和D）Sham控件。（B和E）接受UUO并注射pcDNA3的小鼠。（C和F）接受UUO并注射pFlag-DKK1的小鼠。棒材=40μm。（G） 图示显示不同组的肾间质体积，如图所示。（H） DKK1治疗降低了梗阻肾组织中羟脯氨酸的含量。组织羟脯氨酸表达为μg/mg干肾重**P（P）< 0.01对假对照；†P（P）< 0.05对pcDNA3型(n个=4至5）。
图11。
图11。
DKK1阻断Wnt信号传导抑制梗阻性肾病中I型胶原和纤维连接蛋白的表达。（A和C）如图所示，对不同治疗组的I型胶原（A）和纤维连接蛋白（C）的肾脏mRNA水平进行代表性RT-PCR分析。数字（1、2和3）表示给定组中的每只动物。（B和D）不同组I型胶原（B）和纤维连接蛋白（D）mRNA水平的图示。计算相对mRNA水平，并在β-肌动蛋白正常化后表示为假对照组的折叠诱导（值=1.0）**P（P）< 0.01对假对照；†P（P）< 0.05对pcDNA3型(n个=4至5）。（E） 如图所示，代表性显微照片通过免疫荧光染色显示了不同组中I型胶原和纤连蛋白的定位。巴=40μm。
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