Increased expression of catalase and superoxide dismutase 2 reduces cone cell death in retinitis pigmentosa

doi:10.1038/mt.2009.47

.2009年5月；17(5):778-86.

doi:10.1038/mt.2009.47。 Epub 2009年3月17日。

过氧化氢酶和超氧化物歧化酶2表达增加可减少视网膜色素变性患者的锥细胞死亡

臼井新一¹, 小美惠一, 孙英利, Young-Joon Jo（杨俊珠）, 上野信治, 布莱恩·罗杰斯, 吴志浩, Jikui Shen公司, 陆丽丽（Lili Lu）, 布莱恩·奥文森, 彼得·拉宾诺维奇, 彼得·坎波奇亚罗

附属公司

PMID： 19293779
预防性维修识别码： PMC2803613型
内政部： 10.1038/mt.2009.47

过氧化氢酶和超氧化物歧化酶2表达增加可减少视网膜色素变性患者的锥细胞死亡

Usui信一等。分子治疗. 2009年5月.

.2009年5月；17(5):778-86.

doi:10.1038/mt.2009.47。 Epub 2009年3月17日。

作者

Usui信一¹, 小美惠一, 孙英利, Young-Joon Jo（杨俊珠）, 上野信治, 布莱恩·罗杰斯, 吴志浩, Jikui Shen公司, 陆丽丽（Lili Lu）, 布莱恩·奥文森, 彼得·拉宾诺维奇, 彼得·坎波奇亚罗

附属

¹美国马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯大学医学院眼科21287-9277。

PMID： 19293779
预防性维修识别码：第803613页
内政部： 10.1038/mt.2009.47

摘要

氧化和亚硝化损伤是视网膜色素变性（RP）锥细胞死亡的主要原因。在这项研究中，我们探讨了在RP、rd1和rd10小鼠模型中增强内源性抗氧化防御系统成分的作用。出乎意料的是，rd1小鼠超氧化物歧化酶1（SOD1）的过度表达增加了氧化损伤并加速了锥细胞死亡。通过精心设计的交配方案，产生了在感光细胞线粒体中诱导表达SOD2和/或过氧化氢酶的基因工程rd10小鼠。具有相同遗传背景但没有增加SOD2或过氧化氢酶表达的小白蚁提供了理想的对照。SOD2和过氧化氢酶的共同表达（但不是单独表达）显著降低了出生后第50天（P）第10只小鼠视网膜的氧化损伤（通过蛋白质羰基含量测定）。SOD2和过氧化氢酶同时表达的P50 rd10小鼠的椎体密度显著高于单独表达SOD2或过氧化氢酶或两者均不表达的rd10小鼠。在rd10小鼠中SOD2和过氧化氢酶的共同表达并不能减缓杆细胞死亡。这些数据支持了支持内源性抗氧化防御系统作为RP基因治疗策略的概念，也表明可能需要多种成分的共表达。

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数字

<b>图1</b> — 图1
**超氧化物歧化酶1（SOD1）的过度表达显著降低了细胞的锥功能和锥细胞数量*第1版*^+/+老鼠。**转基因小鼠，其中*肌动蛋白*人类SOD1的启动子驱动表达与*第1版*^+/+小鼠和后代杂交获得*第1版*^+/+携带*草皮1*转基因(*苏打1-rd1*^+/+老鼠）。(一)出生后第25天（P），*第1版*^+/+、和*苏打1-rd1*^+/+小鼠被安乐死，视网膜匀浆用针对人SOD1的抗体进行免疫印迹。免疫印迹（IBs）显示人SOD1在*苏打1-rd1*^+/+并且在*第1版*^+/+老鼠。用针对β-肌动蛋白的抗体剥离和重制IBs表明，负荷相当。(b条)在P25时，通过视网膜匀浆的酶联免疫吸附试验测定的羰基加合物的平均（±SEM）数显示*苏打水1 rd1*^+/+老鼠(n个=6）与*rd1型*老鼠(n个= 9;**P（P）*< 5.0 × 10⁻⁴由未配对的学生t吨-测试）。(**c（c）**)在第35页，与*第1版*老鼠，*苏打1-rd1*^+/+通过共聚焦显微镜观察花生凝集素染色的视网膜扁平支架（比例尺=50µm），小鼠在视网膜的所有四个象限中显示出较低的锥体密度，并通过图像分析证实了这一点(d日; **P（P）*< 2.0 × 10⁻⁴, ***P（P）*< 0.02, ****P（P）*< 0.002, *****P（P）*<0.01（未成对学生）t吨-测试）。(**e（电子）**)P25低背景光照下进行的明视视网膜电图（ERG）的典型波形显示*苏打1-rd1*^+/+老鼠比*第1版*^+/+小鼠和测量证实平均（±SEM）b波振幅显著降低*苏打1-rd1*^+/+小鼠(**P（P）*<0.05，未配对韦尔奇t吨-测试）。

<b>图2</b> — 图2
*10路*^+/+可诱导小鼠感光细胞线粒体中超氧化物歧化酶2（SOD2）和过氧化氢酶的表达增加。(一)的示意图*TRE/草皮2*和*TRE/过氧化氢酶*显示了转基因。这个*四环素反应元件*(*TRE公司*)与全长cDNA偶联*鼠标-Sod2。*鸟氨酸转氨酶(*非处方药*)将介导线粒体定位的前导序列连接到N端cDNA上*人过氧化氢酶*和过氧化物酶体定位信号(请)在偶联到*TRE公司*。使用这些结构，*TRE/草皮2*和*TRE/过氧化氢酶*生成转基因小鼠。(b条)进行多次交叉以生成*TRE/Sod2（+/-）-TRE/过氧化氢酶（+/-）-rd10*^+/+小鼠和纯合子*光受体间视黄醇结合蛋白*发起人/*反向四环素反式激活物-rd10*^+/+老鼠(*IRBP/rtTA（+/+）-rd10*^+/+老鼠）。将这两种小鼠杂交产生四组后代，*零-rd10*^+/+,*苏打2-rd10*^+/+，Catalase-rd10^+/+、和*草皮2/过氧化氢-rd10*^+/+显示基因型的小鼠。(**c（c）**)*零-rd10*^+/+,*苏打2-rd10*^+/+，Catalase-rd10^+/+、和*草皮2/过氧化氢-rd10*^+/+在出生后第10天到第25天，给小鼠饮用正常饮用水或补充2 mg/ml强力霉素的水。对小鼠实施安乐死，并使用针对小鼠SOD2、人过氧化氢酶和小鼠环氧合酶4（COX4）的特异性抗体在免疫印迹中对视网膜匀浆的线粒体部分进行检测，已知其定位于线粒体。所有小鼠的视网膜线粒体中都存在鼠SOD2的背景水平，但当用强力霉素治疗时，只有*苏打2-rd10*^+/+和*草皮2/过氧化氢-rd10*^+/+小鼠SOD2显著增加。同样，当使用强力霉素C治疗时*目录-rd10*^+/+和*草皮2/过氧化氢-rd10*^+/+显示出较强的过氧化氢酶带。所有小鼠的视网膜线粒体中均可见COX4的强条带。

<b>图3</b> — 图3
**线粒体中超氧化物歧化酶2（SOD2）和过氧化氢酶的协同表达可减少视网膜中的超氧化物自由基*第10行*^+/+老鼠。**出生后第35天（P），将氢乙硫胺腹腔注射到野生型小鼠体内(n个= 4),*零-rd10*^+/+按照材料和方法中的描述，在P10和P35之间使用强力霉素治疗的小鼠(n个=4），或*草皮2/过氧化氢-rd10*^+/+在P10和P35之间使用强力霉素治疗的小鼠(n个=4），18小时后对小鼠实施安乐死，并用共焦显微镜检查眼部切片。代表性切片显示野生型小鼠的视网膜荧光极小(**a–c**)，强荧光主要存在于视网膜的剩余外核层（ONL）和外丛状层*零-rd10*^+/+老鼠(**d–f日**)和视网膜中的最小荧光*草皮2/过氧化氢-rd10*^+/+老鼠(**g–i类**). 这表明，在小鼠视网膜外棒变性后，SOD2和过氧化氢酶的共表达降低了超氧化物自由基的显著增加。比例尺=20µm。GCL，神经节细胞层；INL，内核层。

<b>图4</b> — 图4
**过氧化氢酶和超氧化物歧化酶2（SOD2）表达增加显著降低出生后第二天视网膜中的羰基含量（P）50第10行^+/+老鼠。**从P10开始*零-rd10*^+/+,*苏打2-rd10*^+/+,*目录-rd10*^+/+、和*苏打水/过氧化氢酶-rd10*^+/+小鼠和断奶后的小鼠自己用强力霉素治疗。在P35或P50对小鼠实施安乐死，并通过视网膜匀浆的酶联免疫吸附测定法测量蛋白质羰基含量。在P35，每mg视网膜蛋白的平均（±SEM）羰基含量在*苏打2-rd10*^+/+小鼠比*零-rd10*^+/+,*目录-rd10*^+/+，或*草皮2/过氧化氢-rd10*^+/+老鼠(一; **P（P）*< 0.05; ***P（P）*经Tukey–Kramer试验，<0.01）。在P50时，每mg视网膜蛋白的平均羰基含量（±SEM）显著低于*草皮2*/*目录-rd10*^+/+小鼠与*零-rd10*^+/+,*苏打2-rd10*^+/+，或*目录-rd10*^+/+老鼠(b条; ***P（P）*经Tukey–Kramer试验，<0.01）。

<b>图5</b> — 图5
**感光细胞线粒体中超氧化物歧化酶2（SOD2）和过氧化氢酶的表达增加可减少锥体细胞死亡*第10行*^+/+老鼠。**(一)花生凝集素（PNA）染色的视网膜扁平支架的荧光共焦显微镜显示，0.0529 mm的锥体细胞密度差异不大²位于视神经中心上方0.5 mm处*第10行*^+/+出生后第18天或第35天的小鼠（P）与P18时的野生型小鼠相比，但到P50时*第10行*^+/+老鼠。在第18页，野生型和*第10行*^+/+小鼠，但在P35和P50，rd10^+/+小鼠的内节变平，没有外节。比例尺=50µm。(b条)从P10开始*零-rd10*^+/+,*苏打水2 rd10*^+/+,*目录-rd10*^+/+、和*苏打水/过氧化氢酶-rd10*^+/+小鼠在饮用水中服用强力霉素。断奶后，用强力霉素对小鼠进行治疗。在P50时，对小鼠实施安乐死，并对0.0529 mm的PNA染色的视网膜平面进行荧光显微镜检查²显示了距视神经中心0.5毫米的视神经上、下、颞和鼻部。*草皮2/过氧化氢-rd10*^+/+与对照组相比，小鼠视网膜四个区域的锥体密度都更大*零-rd10*^+/+,*苏打2-rd10*^+/+、和*目录-rd10*^+/+老鼠。*苏打2-rd10*^+/+小鼠的锥体密度最低。比例尺=50µm。(**c（c）**)通过图像分析对四个0.0529 mm中的每一个进行锥体密度量化²垃圾箱显示*草皮2/过氧化氢-rd10*^+/+小鼠的平均（±SEM）锥体密度显著高于*苏打2-rd10*^+/+视网膜上象限、下象限和鼻象限的小鼠(**P（P）*< 0.05, ***P（P）*经Tukey–Kramer试验，<0.01）。*草皮2/过氧化氢-rd10*^+/+小鼠的锥体密度明显大于*零-rd10*^+/+小鼠位于下象限和鼻象限。*草皮2/过氧化氢-rd10*^+/+小鼠的锥体密度明显大于*目录-rd10*小鼠在鼻象限。比例尺=50µm。(d日)对每个小鼠四个象限中的每个象限的锥体密度测量值进行合并，以提供每个视网膜的单个锥体密度测定值。P50中每个视网膜的平均（±SEM）锥体密度显著高于*草皮2/过氧化氢-rd10*^+/+小鼠与*零-rd10*^+/+,*苏打2-rd10*^+/+，或*目录-rd10*^+/+小鼠(***P（P）*经Tukey–Kramer试验，<0.01）。

<b>图6</b> — 图6
**超氧化物歧化酶2（SOD2）和/或过氧化氢酶的过度表达不能阻止*第10行*^+/+老鼠。**棒细胞死亡导致外核层（ONL）逐渐变薄*第10行*^+/+老鼠。通过Tukey–Kramer试验，多西环素治疗小鼠ONL厚度的测量结果显示*零-rd10*^+/+,*苏打2-rd10*^+/+,*目录-rd10*^+/+、和*草皮2/过氧化氢-rd10*^+/+P25小鼠(一)和第35页(b条). 条形图显示平均值（±SD）。

<b>图7</b> — 图7
**在出生后第50天（P），超氧化物歧化酶2（SOD2）和过氧化氢酶的表达增加可保持某些锥细胞功能*第10行*^+/+老鼠。（a）**在第35页进行了近视视网膜电图（ERG）检查*零-rd10*^+/+,*苏打2-rd10*^+/+,*目录-rd10*^+/+、和*草皮2/过氧化氢-rd10*^+/+用强力霉素治疗的小鼠。绘制了四组小鼠四种不同刺激强度的平均（±SEM）b波振幅，没有显著差异。(b条)按照第50页材料和方法中的描述进行低背景明视ERG。四组中的每一组都显示了代表性波形，并在*苏打水/过氧化氢酶-rd10*^+/+小鼠与*零-rd10*^+/+,*苏打2-rd10*^+/+，或*目录-rd10*^+/+老鼠。条形图显示了平均（±SEM）明视b波振幅，显著高于(***P（P）*<0.01（通过Tukey–Kramer测试）*草皮2/过氧化氢-rd10*^+/+将小鼠与其他三种类型的小鼠进行比较。

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