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.2009年6月；19(6):959-66.
doi:10.1101/gr.083451.108。 Epub 2009年3月9日。

寻找第五个碱基：胞嘧啶甲基化的全基因组测序

瑞安·李斯特 1, 约瑟夫·埃克尔
附属公司
审查

寻找第五个碱基：胞嘧啶甲基化的全基因组测序

瑞安·李斯特等。 基因组研究. 2009年6月.

摘要

现在可以获得无数真核生物基因组的完整序列，包括几个人类基因组，DNA测序技术的最新重大发展为海量序列数据打开了大门。然而，尽管几十年来人们都知道植物和动物基因组中有很大一部分胞嘧啶是以甲基胞嘧啶的形式存在的，但直到最近，这些修饰碱基的精确位置还没有在真核生物基因组中准确定位。先进的“下一代”DNA测序技术现在能够以单碱基分辨率对这种表观遗传修饰进行全球定位，为基因组中DNA甲基化的调控和动力学提供了新的见解。

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数字

图1。
图1。
胞嘧啶甲基化位点的全基因组测序技术。描述了最近用于生成与下一代测序兼容的亚硫酸氢盐（BS）测序库的三种技术。(A类)甲基C-序列（Lister等人，2008年）。将所有胞嘧啶甲基化的双标记通用适配器序列连接到片段基因组DNA。亚硫酸氢钠处理将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，然后通过PCR扩增文库，并使用与通用适配器序列互补的引物富集文库，生成可测序的最终文库。(B类)BS-seq（Cokus等人，2008年）。在靠近基因组DNA连接位点的DpnI限制位点内连接第一组含有甲基化腺嘌呤碱的双链适配器。在BS转换后，使用与转换后的适配器序列互补的引物进行PCR，产生双链DNA，用DpnI消化以仅去除第一组适配器。测序适配器随后连接到双链BS转化的基因组DNA片段，并使用与适配器互补的引物进行PCR，以生成测序库。(C类)减少代表性BS测序（RRBS）（Meissner等人，2008年）。基因组DNA首先被甲基化敏感的MspI限制酶消化，该酶在其CCGG识别元件中裂解CpG二核苷酸上游的磷酸二酯键。然后通过凝胶电泳分离消化的DNA，并选择一个或多个特定的粒级。然后，对大小选择的DNA进行末端修复，连接到双链甲基化测序适配器（如上所述的甲基C-seq），进行BS转换，并使用与适配器序列互补的引物通过PCR进行扩增。
图2。
图2。
BS测序前甲基化或靶区富集技术。描述了在BS转换和下一代测序之前用于降低样品复杂性的五种方法，目标是甲基化区域或选择目标序列。(A类)MeDIP公司。基因组DNA的甲基化片段用抗5-甲基胞嘧啶抗体进行免疫沉淀。纯化的免疫沉淀DNA连接到所有胞嘧啶甲基化的双链通用适配器序列。亚硫酸氢钠处理将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，然后通过PCR扩增文库，并使用与通用适配器序列互补的引物富集文库，生成可测序的最终文库。(B类)MBD公司。基因组DNA的甲基化片段是从片段基因组DNA与甲基结合域蛋白的复杂混合物中分离出来的，然后进行适配器连接、BS转换和PCR富集，如A类. (C类)微阵列捕获。通过与微阵列表面的特定寡核苷酸杂交，捕获片段基因组DNA复杂混合物中的目标序列。在分离杂交基因组DNA后，进行适配器连接、BS转换和PCR富集，如A类. (天)在溶液中捕获。片段基因组DNA混合物中的特定靶区通过与溶液中珠状物附着的特定寡核苷酸杂交来捕获。在分离杂交基因组DNA后，进行适配器连接、BS转换和PCR富集，如A类. (E类)分子反转探针捕获。片段化的基因组DNA经过BS转换，然后添加分子反转探针，设计用于在转换后与特定靶序列杂交。由分子反转探针的3′端引物引发聚合，然后进行连接，生成包含目标序列的圆形分子，并且不被随后的核酸外切酶处理消化。使用杂交到分子反转探针末端的引物进行PCR，可以扩增目标区域，将双链通用适配器序列连接到目标区域，以产生足以进行下一代测序的文库。
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