A targeted inhibitor of the alternative complement pathway reduces angiogenesis in a mouse model of age-related macular degeneration

doi:10.1167/iovs.08-2222

.2009年7月；50(7):3056-64.

doi:10.1167/iovs.08-2222。 Epub 2009年3月5日。

替代补体途径的靶向抑制剂减少年龄相关性黄斑变性小鼠模型的血管生成

巴贝尔·罗勒¹, 秦龙, 贝斯·考夫林, R布鲁克斯·威尔逊, 黄玉祥, 费乔, 彼得·H·唐, 坎南·昆奇塔帕萨姆, 加里·吉尔克森, 史蒂芬·汤姆林森

附属公司

PMID： 19264882
预防性维修识别码： PMC2908507型
内政部： 10.1167/iovs.08-2222

替代补体途径的靶向抑制剂减少年龄相关性黄斑变性小鼠模型的血管生成

巴贝尔·罗勒等。投资眼科视觉科学. 2009年7月.

.2009年7月；50(7):3056-64.

doi:10.1167/iovs.08-2222。 Epub 2009年3月5日。

作者

巴贝尔·罗勒¹, 秦龙, 贝斯·考夫林, R布鲁克斯·威尔逊, 黄玉祥, 费乔, 彼得·H·唐, 坎南·昆奇塔帕萨姆, 加里·吉尔克森, 史蒂芬·汤姆林森

附属

¹美国南卡罗来纳州查尔斯顿市南卡罗莱纳医科大学神经科学系研究部，邮编：29425。rohrer@musc.edu

PMID： 19264882
预防性维修识别码： PMC2908507型
内政部： 10.1167/iovs.08-2222

摘要

目的：因子H（fH）是补体激活替代途径（AP）的抑制剂，其多态性与年龄相关性黄斑变性（AMD）的风险增加有关。作者研究了一种新的重组形式的fH，CR2-fH，其靶向补体激活位点，在小鼠脉络膜新生血管（CNV）中的治疗应用。CR2-fH由小鼠fH的N末端组成，其中包含AP抑制域，与结合补体激活产物的补体受体2（CR2）靶向片段相连。

方法：在因子B缺乏小鼠或经CR2-fH、可溶性CR2（靶向结构域）或PBS治疗的小鼠中分析激光诱导的CNV。通过分子、组织学和电生理读数分析CNV进展。

结果：静脉注射CR2-fH可减小CNV大小，保护视网膜功能，并消除C3和VEGF mRNA的损伤相关表达。CR2和PBS治疗无效。在涉及损伤后延迟治疗的治疗相关范式中，CR2-fH可有效降低CNV，并提供约60%缺乏功能性AP的因子B缺乏小鼠的保护量。静脉注射后，CR2-fH定位于RPE脉络膜C3沉积部位。

结论：AP的特异性抑制可减少小鼠CNV的血管生成。值得注意的是，静脉注射C3d靶向的CR2-fH具有保护作用，即使血清中存在较高相对浓度的内源性fH，并且血清fH含有天然C3d和靶向细胞表面的细胞表面结合域。fH最常见的AMD相关变体位于fH的天然细胞结合区域（Tyr402His）。这些数据可能为AMD治疗策略开辟新的途径。

PubMed免责声明

数字

图1
CNV开发文件。用激光光凝Bruch膜诱导CNV。(A类–C类)异凝集素B4染色可突出新形成的小鼠血管，用于记录CNV病变随时间的增大。共焦显微镜，捕获Z-对所有实验使用相同的激光强度设置，对每个CNV病变的整个深度进行图像叠加。(D类,E类)绘制强度剖面图并分析病变大小（荧光峰值和曲线下面积；积分荧光）。(F类)通过视网膜电图测定病变（或治疗）对视网膜功能的影响，显示CNV诱导6天后a波和b波（分别为感光细胞和双极细胞反应）的ERG振幅降低。(**G公司**)共焦显微镜测定的病灶大小的增加与ERG振幅的降低相关（病灶被归一化为2周后测定的最大大小；ERG b波以基线振幅的百分比表示）。比例尺，50μ米。

图2
CR2 fH处理和fB缺陷小鼠的CNV。用isolectin-B4染色法在激光光凝6天后评估CNV的发展。(A类)代表性图像(B类)数据的相应量化（病变大小、综合像素强度）。(A类)*循环流化床*^−/−老鼠(n个=18）或重量老鼠(n个=12）静脉注射PBS治疗(n个=19），CR2（133μ克；n个=9）或CR2-fH（250μ克；n个＝11）在激光光凝后的第0、2和4天。CR2-fH处理和*循环流化床*^−/−将动物与PBS和CR2治疗的对照组进行比较。(B类)病变大小的比较表明缺乏替代途径(*循环流化床*^−/−)与PBS或CR2对照组相比，CNV大小减少约65%，而CR2-fH抑制AP使CNV大小降低40%。不另作说明，不重要。

图3
CR2-fH治疗和fB缺乏小鼠的CNV和视网膜功能。在激光光凝前（基线）和实验结束时（CNV 6天后），在2.48明视cd·s/m的单光强度下使用单闪光ERG记录进行ERG记录²（参见图1了解ERG轨迹重量，C57BL/6只动物。）ERG反应分析来自(A类)*循环流化床*^+/+和*循环流化床*^−/−小鼠和(B类)重量用PBS或CR2-fH治疗的小鼠。(A类)基线时的A波和b波振幅相同*循环流化床*^+/+和*循环流化床* ^−/−老鼠。然而，在CNV诱导后，发现了基因型依赖性差异。*循环流化床*^+/+CNV后小鼠表现出ERG振幅的显著损失，而ERG振幅在*循环流化床*^−/−老鼠。(B类)静脉注射CR2-fH（250μ与PBS处理的小鼠相比，激光损伤后第0、2和4天服用g。(C类)ERG数据汇总，显示ERG a波占基线振幅的百分比*循环流化床*^+/+和*循环流化床*^−/−以及PBS和CR2-fH比较。

图4
CNV中VEGF和C3 mRNA表达的分析。(A类)对激光光凝后1、3和6天取出的RPE脉络膜样品进行定量RT-PCR。通过循环数获得定量值(C类_t吨值），确定平均实验值（VEGF或C3）和对照值之间的差异(β-肌动蛋白）ΔC类_t吨值。VEGF和C3 mRNA表达在激光损伤后1天即显著增加，3天后达到峰值。(B类)激光光凝后第1天取出的RPE脉络膜样本的QRT-PCR倍差重量和*循环流化床*^−/−,和重量用PBS或CR2-fH治疗的小鼠。AP通路激活消除后，VEGF和C3 mRNA表达显著降低(*循环流化床*^−/−)或被抑制（CR2-fH）。每组评估四只动物的眼睛。

图5
CNV病变中的C3d沉积。(A类)直接结合FITC的C3d抗体免疫组化比较C3d沉积(左边)C3d染色覆盖小鼠视网膜的差异干涉对比图像(*正确的*)冻结段。通过CNV病变拍摄切片照片，可以通过色素RPE脉络膜的损伤来识别。在激光照射后12小时观察到显著的C3d沉积；在第3天，它一直处于升高状态，到第6天，它似乎开始下降。(B类)RPE脉络膜的平板分析显示抗C3d标记优先位于病变边缘。IS/OS（光感受器），内段/外段；ONL、外核层、OPL、外丛状层。

图6
CR2-fH定位于CNV病变。CR2-fH的抗-CR2免疫荧光染色。给动物注射治疗剂量的CR2-fH（250μg）激光光凝后第3天，24小时后取眼。(A类)整体免疫荧光显微镜显示CR2-fH注射眼中存在CR2-阳性物质，PBS注射眼中显著减少；当一抗被省略时（阴性对照），未观察到染色。(B类)免疫荧光定量分析证实CR2-fH定位于病变部位。

图7
延迟CR2-fH治疗对CNV进展的影响。比较了CR2-fH治疗的三种时间模式在减少CNV大小方面的疗效。所有动物在第0天接受激光光凝。对于急性治疗，在激光损伤时首次注射CR2-fH（第6天进行分析；见图2）；对于延迟治疗，在激光损伤后第3天（第9天分析）或第6天（第12天分析）首次给予CR2-fH治疗。根据开始治疗的日期绘制数据（急性、延迟3天和延迟6天）。比较对象是(A类)间接尺寸测量和(B类)ERG b波振幅。使用急性治疗范式将CNV大小测量值标准化为PBS治疗获得的最大大小。激光治疗前，将b波ERG振幅标准化为基线值。在急性治疗的动物和延迟3或6天治疗的动物中，CNV大小和ERG b波振幅的降低显著降低（由于设备故障，ERG不能用于6天组）。每个治疗组评估8只动物(**P（P）*< 0.005; #*P（P）*< 0.05).

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