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.2009年5月1日；284(18):12207-16.
doi:10.1074/jbc。M807920200。 Epub 2009年3月4日。

β1整合素I型结构域的N-糖基化对β1整合素的表达和生物功能至关重要：确定α5β1的最低N-糖基化合要

Tomoya Isaji先生 1, 佐藤裕雅, 福田富美彦, 顾建国
附属公司

β1整合素I型结构域的N-糖基化对β1整合素的表达和生物功能至关重要：确定α5β1的最低N-糖基化合要

Tomoya Isaji先生等。 生物化学杂志. .

摘要

整合素α5beta1的N-糖基化在细胞扩散、细胞迁移、配体结合和二聚体形成中起着关键作用，但N-糖基化介导这些功能的详细机制尚不清楚。在之前的研究中，我们发现α5亚基的β-推进器上的三个潜在的N-糖基化位点（α5S3-5）对亚基的功能表达至关重要。特别是，位点5（alpha5S5）对于其在细胞表面的表达是最重要的。在本研究中，使用连续定点突变来去除组合的假定N-糖基化位点，研究了N-聚糖在整合素β1亚基上的功能。去除β1亚基（即Delta4-6突变体）I型结构域上的N-糖基化位点降低了表达水平和异二聚体形成，从而抑制了细胞扩散。有趣的是，只有当β1亚基具有这三个N-糖基化位点（即S4-6突变）时，才能观察到细胞扩散。此外，S4-6突变体可以与α5亚单位的α5S3-5或α5S5突变体形成异二聚体。综上所述，本研究结果首次揭示了β1亚基I型结构域的N-糖基化对亚基的异二聚体形成和生物功能至关重要。此外，由于α5S3-5/β1S4-6突变体代表β1亚基功能表达所需的最小N-糖基化，因此它也可能对分子结构的研究有用。

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数字

图1。
图1。
电位示意图N个-糖基化位点在整合素β1亚基上。与假设相对应的站点N个-β1亚基（Asn）上的糖基化位点50,Asn公司94，阿斯恩97、Asn212、Asn269,Asn公司363、Asn406、Asn417、Asn481,Asn公司520、Asn584、和Asn669)显示为灰色箭头. The十字架代表移除各糖基化N个-聚糖定点突变，即Asn至Gln。表皮生长因子表皮生长因子。
图2。
图2。
糖基化对β1亚基表达和β1亚基与α亚基的结合。 A类,GFP表达细胞（对照）、WT和一些如图所示（Δ1-3、Δ4-6和Δ9-12）用抗整合素β1抗体（JB1A）和抗α-微管蛋白抗体（DM1A）作为负荷控制。B类,免疫沉淀等量的细胞裂解物(IP（IP）)带有抗β1整合素（P5D2）。然后对免疫沉淀物进行处理至6%SDS-PAGE并进行印迹(IB公司)抗α5（H-104）和抗β1整合素（JB1A）抗体。装载等量的使用抗α-微管蛋白验证总细胞裂解物中的蛋白质抗体。C、，定量数据表示为相对比率抗β1免疫沉淀中α5/β1亚基的表达。光学使用ImageJ测量α5和β1亚基带的密度软件。α5的比率与设置野生型β1100。数据来自三个独立实验（平均值±S.D.）。**,第页<0.01根据学生的双尾t吨测试。
图3。
图3。
细胞表面表达的比较及其与α亚单位。 A类，等效大量细胞裂解物被免疫沉淀(IP（IP）)使用抗β1整合素（P5D2），然后免疫沉淀至6%SDS-PAGE并进行印迹(IB公司)抗α5（H-104）或抗β1（JB1A）抗体。在用抗α-微管蛋白抗体验证总细胞裂解物。B类，检测细胞表面β1整合素的表达使用FACS分析。在分析之前，将细胞与抗β1抗体（P5D2），然后与Alexa Fluor 488山羊孵育“实验程序”中所述的抗鼠IgG阴性对照染色(阴影直方图)在没有第一抗体。C、，α亚基的相对表达水平细胞表面。用大鼠抗α5抗体和然后用Alexa Fluor 633山羊抗鼠IgG孵育。表达式α5亚基水平表示为相对荧光强度使用FACS分析进行检查。野生型的荧光强度α5亚基设为100。
图4。
图4。
的影响N个-β1Ⅰ型结构域上的糖基化翻译后处理、稳定性和细胞定位。 A类，代谢标记后[35S] 蛋氨酸和-半胱氨酸作用30分钟，用新鲜培养基清洗细胞，有或没有蛋白酶体抑制剂MG-132，最终浓度为8μ米，然后在指定的时间追赶。这些细胞是裂解，并免疫沉淀等量的细胞裂解物(IP（IP）)在指定的时间使用抗β1（JB1A）抗体。这个按照“实验程序。”M（M）和对指示的迁移位置α5和β1亚基的成熟和前体形式。B类用抗β1亚单位的小鼠抗体对细胞进行染色（JB1A）和兔抗calnexin抗体(CNX公司)（SPA-860），随后通过可视化山羊抗小鼠IgG-结合Alexa 488抗体和兔IgG结合物Alexa 546。这个酒吧表示20微米。
图5。
图5。
不同糖基化程度低的细胞在FN上扩散的比较β1亚单位的突变体。 A类，分离细胞并重新放置在预先涂有5μg/ml FN的培养皿上。孵育后20min，用3.7%多聚甲醛固定细胞使用200倍相位对比显微镜拍摄现场照片。这个酒吧表示200μm。B、，细胞扩散的量化FN表示为三个独立实验的平均值±S.D。C、，用RT-CES系统进行细胞粘附动力学分析在“实验程序”下。细胞指数是指细胞的范围粘附。这个酒吧显示标准偏差。
图6。
图6。
最小N个-α5β1二聚体的糖基化需求形成。 A、，两次糖基化的示意图含有GFP标签的α5亚单位突变体。对应的站点假定N个-糖基化位点（Asn84,Asn公司182、Asn297、Asn307、Asn316,Asn公司524、Asn530、Asn593、Asn609,Asn公司675、Asn712、Asn724、Asn773,和Asn868)α5亚基上的灰色箭头. The十字架代表糖基化的去除在每个N个-聚糖逐点定向诱变。α5S3-5和α5S5表示移除除所示位置以外的所有位置地点，即Asn公司297/Asn公司307/Asn公司316,和Asn316分别是。IP（IP）免疫沉淀；工作分解结构，Western blot。B类，细胞表达N个-α5（α5S3-5和α5S5）糖基化突变体感染了含有WT或N个-糖基化β1亚单位的突变体（Δ4-6和S4-6），如下所述“实验程序”。细胞裂解物是用抗GFP抗体免疫沉淀，免疫复合物进行SDS-PAGE并用抗β1亚单位（JB1A）进行印迹(上面的面板). 使用抗β1亚单位对总细胞裂解物进行印迹抗体（JB1A）(中间面板)和抗GFP抗体(降低面板).
图7。
图7。
WT和糖基化突变体的特性可溶性α5β1整合素。 A类，细胞外部分α5（1-644）和β1（1-501）亚单位(黑体)分别与酸肽和碱肽融合装箱的7种氨基酸指示烟草蚀纹病毒的识别序列(TEV公司)所述蛋白酶(27). SDS-PAGE和免疫印迹对纯化的重组整合素进行了分析。纯化的WT和整合素α5β1的糖基化不足突变体，制备为在“实验程序”中描述，受到6%使用考马斯亮蓝R-250进行SDS-PAGE可视化(哥伦比亚广播公司)(B类)，抗α5免疫印迹（4705S）(C类)，或β1单克隆抗体（JB1A）(D类)减少不足(左侧)和非还原性(右侧)条件。工作分解结构，Western blot。这个括号指示WT和重组整合素的α5S3-5/β1S4-6糖基化突变体。电子，WT和整合素的α5S3-5/β1S4-6糖基化不足突变体。等效物将一定量的重组整合素添加到含有涂上FN（5μg/ml）。然后在37℃孵育平板3小时°C，存在1m米氯化锰2(灰色条)或10米米乙二胺四乙酸(露天酒吧). 结合整合素为用抗α5抗体（HA5）和碱性试剂定量如“实验程序。”
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    1. Takagi，J.（2007）当前版本。操作。细胞生物学。19 557-564-公共医学
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