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.2009年4月24日；284(17):11237-46.

doi:10.1074/jbc。M808327200。 Epub 2009年2月27日。

p38alpha和p38gamma通过不同机制介导致癌ras诱导的衰老

Jinny Kwong（金妮·光）¹, 李新红, 廖蓉（音）, 邓庆东, 贾怀汉, 孙培青

附属公司

PMID： 19251701
预防性维修识别码： PMC2670128型
内政部： 10.1074/jbc。M808327200型

p38alpha和p38gamma通过不同机制介导致癌ras诱导的衰老

Jinny Kwong（金妮·光）等。生物化学杂志. 2009.

.2009年4月24日；284(17):11237-46.

doi:10.1074/jbc。M808327200。 Epub 2009年2月27日。

作者

Jinny Kwong（金妮·光）¹, 李新红, 廖蓉（音）, 邓庆东, 贾怀汉, 孙培青

附属

¹美国加利福尼亚州拉霍亚斯克里普斯研究所分子生物学和凯洛格科学技术学院系，邮编：91037。

PMID： 19251701
预防性维修识别码： PMC2670128型
内政部： 10.1074/jbc。M808327200型

摘要

癌基因诱导衰老是正常细胞中某些癌基因激活后触发的一种肿瘤抑制防御机制。最近，对癌基因激活的衰老反应被证明是体内癌症发展的真正屏障。此前的多项研究表明p38 MAPK通路在肿瘤诱导衰老中的重要性。然而，四种p38亚型（由不同基因编码）对衰老诱导的贡献尚不清楚。在目前的研究中，我们证明了p38alpha和p38gamma，而不是p38beta，在致癌ras诱导的衰老中起着重要作用。p38alpha和p38gamma均在原代人成纤维细胞中表达，并在致癌ras转导后被激活。小发夹RNA介导的p38alpha或p38gamma表达沉默可消除ras诱导的衰老，而p38alfa和p38gama的结构性激活可导致过早衰老。此外，在致癌ras激活后，p38gamma通过磷酸化Ser（33）处的p53来刺激p53的转录活性，这表明p38gama介导衰老的能力至少部分是通过p53实现的。然而，p38alpha通过介导ras诱导的p16（INK4A）表达（另一个关键的衰老效应器），通过p53诱导细胞衰老机制，促进ras诱导衰老。这些发现已确定p38alpha和p38gamma是调节肿瘤抑制衰老反应的信号通路的重要组成部分，为深入了解p38亚型在衰老诱导中不同参与的分子机制提供了线索。

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数字

图1。 — 图1。
p38α、-β和-γ亚型在原代细胞中表达人成纤维细胞与致癌激活拉斯在期间衰老诱导。 A类BJ细胞（PD26）的Western blot分析用检测FLAG-p38和肌动蛋白的FLAG-tagged p38亚型转导。B转染FLAG-p38的BJ细胞的Western blot分析亚型和Ha-RasV12(Ras公司)、MKK3E或矢量(白色),检测磷酸化p38、FLAG、Ras、MKK3和肌动蛋白。在第8天裂解细胞PD30时Ras后转导。C类，诱导的激酶活性ATF2的FLAG-p38亚型拉斯.FLAG-p38亚型用FLAG-p38和Ha-RasV12转导的BJ细胞免疫沉淀或Ras转导后第8天PD30的载体（与B)使用琼脂糖缀合的抗FLAG M2抗体并孵育在存在[γ]的情况下使用GST-ATF2-³²P] ATP。磷酸化放射自显影检测ATF2。ATF2的输入由以下公式确定考马斯亮蓝R染色。D类，蛋白质印迹分析用Ha-RasV12、MKK3E或载体转导的BJ细胞检测磷酸化p38，p38α、p38β和p38γ使用特定抗体。细胞是在Ras转导后第8天在PD25处裂解。每组相同的裂解物含有用载体Ha-RasV12转导的BJ细胞裂解物的集合，或MKK3E在相同的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上并排溶解转移到硝化纤维膜上。膜被切成了碎片，每个含有一组裂解物。这些膜片当时是与磷酸化p38、-p38α、-p38β抗体杂交-p38γ。化学发光信号在将膜重新对准到原始位置。的位置p38α、p38β和p38γ标记为箭头.

图2。 — 图2。
p38α对拉斯-诱导衰老，但不是为了p53在Ser的磷酸化³³或p21的诱导^{WAF1（加权平均1）}表达式。 A类，用抗GFP shRNA转导的BJ细胞（shGFP）或p38α（shp38α-577、-756或-758）和Ha-RasV12(Ras公司)或向量(白色)进行Western blot分析，检测指示蛋白质。在Ras转导后第10天PD34时对细胞进行裂解(左侧面板)或PD35(右侧面板).B，的用shGFP或shp38α-577转导的BJ细胞的群体倍增，-在16天内跟踪756或-758和Ha-RasV12或载体，从Ras转导后第5天开始，PD34(顶部面板)或PD35(底部面板). 重复值为平均值±S.D。C类、BJ细胞系（如中所述B)为Ras转导后第15天的SA-β-gal衰老标记。值为副本的平均值±S.D。

图3。 — 图3。
p38γ对拉斯-诱导衰老，p53在Ser的磷酸化³³和归纳第21页^{WAF1（加权平均1）}表达式。 A类，用shGFP转导的BJ细胞或shp38γ-550或-1023和Ha-RasV12(Ras公司)或矢量(白色)进行Western blot分析，检测蛋白质。在Ras转导后第8天的PD36时对细胞进行裂解。B,shGFP或shp38γ-550转导BJ细胞的群体倍增或-1023和Ha-RasV12或载体在12个周期内进行跟踪(左边面板)或23(右侧面板)天，从Ras后的第5天开始PD36的转导(顶部面板)或PD35(底部面板).重复值为平均值±S.D。C类，BJ细胞系（如所述B)对SA-β-gal衰老标记进行染色Ras转导后第17天。数值为平均值±S.D重复。

图4。 — 图4。
组成活性p38α和p38γ，但不包括p38β，诱导人原代成纤维细胞早衰。 A类和B载体转导BJ细胞的Western blot分析对照组（Babe Puro，英国石油公司). Ha-RasV12型(Ras公司),血凝素标记的野生型p38α、p38γ或p38β(重量)或其活性突变体（p38αD176A、p38γD179A或p38βD176A）检测指示蛋白。细胞是在转导后第8天PD33时裂解。C类人口翻了一番中描述的BJ细胞系A类和B被跟踪了6 (左侧面板)或12(中间的和右侧面板)天，转导后第5天开始，PD32。数值为平均值±S.D重复。^*,第页< 0.001;^**,第页< 0.01; #,第页> 0.05,与矢量控制学生的吨测试。D类、BJ细胞系（如中所述A类)在第14天对SA-β-gal衰老标记进行染色后转导。中的值为重复值的平均值±S.D。^*,第页< 0.01; #,第页> 0.05,与学生的病媒控制吨测试。

图5。 — 图5。
p38γ而非p38α对致癌至关重要拉斯-诱导p53的转录活性。 A类，BJ细胞由启动子驱动的逆转录病毒荧光素酶报告子稳定转导包含功能性p53绑定站点（PG-Luc，顶部面板)或突变p53结合位点（MG-Luc，底部面板)是用编码shGFP或shp38γ-756或-758的逆转录病毒转导PD33和Ha-RasV12(Ras公司)或向量(白色)PD35。细胞在Ras转导后第8天进行裂解。B，BJ细胞稳定由启动子驱动的逆转录病毒荧光素酶报告子转导包含功能性p53绑定站点（PG-Luc，顶部面板)或突变p53结合位点（MG-Luc，底部面板)是用编码shGFP或shp38γ-550或-1023的逆转录病毒转导PD28和在PD30带有Ha-RasV12或载体。Ras后第8天裂解细胞转导。在A类和B，测定荧光素酶活性并归一化为蛋白质浓度。数值为平均值±S.D一式三份。注意，荧光素酶值在细胞之间不可比较用PG-Luc和MG-Luc作为荧光素酶活性的测定在不同的灵敏度设置下使用不同体积的裂解物照度计。C类和D类BJ细胞的Western blot分析用shGFP或shp38γ-550或-1023和Ha-RasV12或载体转导(C类)或带有shGFP或shp38α-756或-758和Ha-RasV12或载体(D类)检测指示的蛋白质。在第8天裂解细胞(C类)或第10天(D类)PD36时的转导后(C类)或PD35型(D类).E类、转导IMR90细胞的Western blot分析p38α的shRNA(第页α756, -758)或p38γ(第页γ1023)和Ha-RasV12或矢量控制检测指示的蛋白质。在感染后11天制备细胞裂解物拉斯在PD36处。F类转导BJ细胞的Western blot分析带病媒控制（Babe Puro，英国石油公司). Ha-RasV12，血凝素标记野生型p38α、p38γ或p38β(重量)，或其活动突变体（p38αD176A、p38γD179A或p38βD176A），检测指示蛋白质。在转导后第8天PD33时对细胞进行裂解。

图6。 — 图6。
重组或免疫沉淀p38α对p53的磷酸化作用和p38γ体外. A类，重组p38γ磷酸化p53。His-p38γ首先与GST-MKK6E（+）或缓冲液（-）和冷ATP，然后使用底物MBP或p53(–61)在[γ]存在下-³²P] ATP。B，重组p38α在血清中磷酸化p53³³和Ser⁴⁶,而重组p38γ磷酸化Ser³³只有。His-p38α或-p38γ首先与GST-MKK6E和冷ATP孵育然后是p53(–61)(重量，野生型）或p53(–61)携带S33A或S46A突变[γ-³²P] ATP。C类，p38γ免疫沉淀自衰老细胞对p53的激酶活性比p38α确实如此。从BJ免疫沉淀FLAG-p38α或-p38γ用FLAG-p38α或-p38γ和Ha-RasV12转导的细胞(Ras公司)、MKK3E或矢量(白色)Ras后第8天PD30使用琼脂糖结合的抗FLAG M2抗体进行转导并培养带有p53(–61)在[γ]存在下-³²P] ATP。同一细胞裂解为在图的图例中描述。1B用于免疫沉淀。的一部分免疫沉淀物经Western blot分析检测FLAG-p38。D类衰老细胞磷酸化物中p38γ免疫沉淀Ser处的p53³³.FLAG-p38γ免疫沉淀物来自对照组(白色)或Ras-expressing BJ细胞(Ras公司)，如中所述C类，与野生型或突变型（S15D、S33D或S46D）p53孵育(–61)在[γ]存在下-³²P] ATP。A–D，的反应用SDS-PAGE分离。磷酸化MBP、p53和p38使用荧光成像仪检测。基板的输入已确定考马斯亮蓝R染色。

图7。 — 图7。
p38α而非p38γ对致癌至关重要拉斯-诱导p16增加^{INK4A（墨水）}mRNA水平。总计从shGFP、shp38α-756或shp38γ-550和Ha-RasV12(Ras公司)或向量(白色)第8天用Ras转导后，在琼脂糖凝胶上分离，转移到尼龙中膜，并与人类p16杂交^{INK4A（墨水）}cDNA探针标记随机启动。信号被可视化并用荧光成像仪。这个数字表示的相对强度第16页^{INK4A（墨水）}Ras细胞的信号归一化为来自病媒控制细胞的信号。

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