Removal of Hsf4 leads to cataract development in mice through down-regulation of gamma S-crystallin and Bfsp expression

doi:10.1186/1471-2199-10-10

.2009年2月19日10时10分。

doi:10.1186/1471-2199-10-10。

去除Hsf4通过下调γ-S-晶体蛋白和Bfsp的表达导致小鼠白内障的发生

小河石¹, 崔斌, 王竹刚, 林翁, 徐忠平, 马金金（Jinjin Ma）, 徐国通, 香港湘阴, 胡岚天

附属公司

PMID： 19224648
预防性维修识别码：项目经理2653017
内政部： 10.1186/1471-2199-10-10

去除Hsf4通过下调γ-S-晶体蛋白和Bfsp的表达导致小鼠白内障的发生

小河石等人。 BMC分子生物学. 2009.

.2009年2月19日10时10分。

doi:10.1186/1471-2199-10-10。

作者

小河石¹, 崔斌, 王竹刚, 林翁, 徐忠平, 马金金（Jinjin Ma）, 徐国通, 香阴岗, 胡岚天

附属

¹中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所和上海交通大学医学院瑞金医院，上海200025。sxhiii@sina.com

PMID： 19224648
预防性维修识别码：项目经理2653017
内政部： 10.1186/1471-2199-10-10

摘要

背景：热休克转录因子4（HSF4）突变与常染色体显性板层性白内障和马纳性白内障相关。Hsf4基因的破坏会导致小鼠的晶状体缺陷，这表明在晶状体发育过程中纤维细胞分化需要Hsf4。然而，无论是HSF4和结晶蛋白之间的关系，还是HSF4维持晶状体透明度的详细机制，都没有被完全理解。

结果：为了确定HSF4缺失导致白内障形成的潜在生物医学和生理机制，我们建立了一个HSF4基因敲除小鼠模型。我们发现Hsf4基因敲除小鼠（Hsf4-/-）部分模拟了Hsf4突变引起的人类白内障。Q-PCR分析显示Hsf4-/-小鼠晶状体中几个与白内障相关的基因下调，包括γ-S-晶体蛋白（Crygs）和晶状体特异性珠丝蛋白1和2（Bfsp1和Bfsp2）。使用双核糖核酸酶系统进行的转录活性分析表明，这些白内障相关基因是HSF4的直接下游靶点。HSF4对γ-S-晶体蛋白的影响通过HSF4-/-，rncat交叉中的白内障形成来证明。全基因组裂解物的2D电泳分析显示，与野生型Hsf4-/-小鼠相比，8周龄Hsf4-/小鼠的表达模式不同，包括一些α-a-晶体蛋白修饰的丢失和γ-晶体蛋白表达的减少。

结论：我们的结果表明，HSF4对晶状体发育足够重要，HSF4基因的破坏至少通过三条途径导致白内障：1）γ-晶体蛋白，特别是γ-S-晶体蛋白的下调；2）晶状体珠状纤维表达减少；和3）αA晶体蛋白的翻译后修饰丢失。

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数字

图1
*Hsf4型*敲除导致晶状体异常和发育缺陷，尤其是肿胀和松散的纤维结构. (A类)野生型*Hsf4型*显示了位点、靶向载体和同源重组后的等位基因。靶向载体被用于用新霉素耐药基因替换编码DNA结合域的外显子3-5。(B类)基因组DNA、cDNA和蛋白质分析*Hsf4型*来自的基因*Hsf4型*通过PCR、RT-RCR和Western blotting分析敲除小鼠。靶外显子侧翼的PCR引物扩增出2.6kb和1.6kb条带*Hsf4型-/-*和*Hsf4型+/+*小鼠。的野生型表达式丢失*Hsf4型*用靶区内的一个引物对总RNA进行逆转录-PCR后，由于缺乏PCR产物，Hsf4-/-小鼠中的基因得到了确认。使用针对小鼠Hsf4蛋白的特异性抗体对8周龄小鼠晶状体提取物进行的Western blot分析表明，Hsf4-/-小鼠中不存在Hsf4蛋白质。(C类)小鼠晶状体的裂隙灯图像和8周龄小鼠晶状体核区切片的组织学检查。箭头表示晶状体核区正常和疏松的纤维*Hsf4+/+，Hsf4+/-*和Hsf4-/-小鼠。酒吧，50 um(天)SEM图像显示松脱和异常纤维*Hsf4型*基因敲除小鼠与野生型小鼠正常结构的比较。酒吧，500微米以上，5微米以下。

图2
**晶状体发育过程中γ-晶体蛋白的表达**. (A类)8周龄野生型和*Hsf4型*击倒老鼠。使用10个野生型镜片和16个淘汰镜片计算平均重量。(B类)用定量RT-PCR分析所有γ-晶体蛋白的mRNA水平。新生儿和8周龄小鼠晶状体中mRNA的分离(C类)使用特异性引物实时PCR分析γS-晶体蛋白mRNA水平。从分别转染HSF4b、HSF4的shRNA或HSF4b+HSF4 shRNA的人晶状体上皮细胞（SRA01/04）中分离出总RNA。(天)七种γ-晶体蛋白的启动子序列比对。与经典热休克因子（HSE）序列相同的序列以红色显示。星号表示热休克因子结合所必需的关键核苷酸。(E类)从转染HSF4b的人晶状体上皮细胞（SRA01/04）的染色质免疫沉淀富集DNA中扩增CRYGS基因启动子。(F类)通过转染HSF4a或HSF4b在人类晶状体上皮细胞中的启动子-荧光素酶构建物（CRYGS-luc）的相对荧光素素酶活性（SRA01/04）。以六倍体进行转染，以Renilla荧光素酶质粒作为标准化对照。结果显示为具有标准偏差的平均值。经典HSE-luc被用作阳性对照。

图3
**交叉*Hsf4型*击倒鼠标和*rncat公司*鼠标**.（A）不同基因型小鼠的裂隙灯白内障评估。缺乏*Hsf4型*在杂合子和纯合子中诱导了更严重的表型*rncat公司*老鼠。**（B）**γS-晶体蛋白mRNA水平*Hsf公司+/+*,*rncat/rncat*,*Hsf4-/-/rncat/rncat*，以及*Hsf4-/-/rncat/+*采用半定量RT-PCR对小鼠进行分析。

图4
***高铁四号线*调节镜片专用珠丝*Bfsp1型*和*Bfsp2***. (A类)实时PCR测定*Bfsp1型*和*Bfsp2*新生儿和成人野生型和*Hsf4型*击倒老鼠。**（B）**PCR分析*Bfsp2型*基因缺失*Hsf4型*^-/-,*Hsf4型*^+/-129S3和C57BL/6J小鼠，使用129S3小鼠Bfsp2基因缺失区域的引物。结果表明，在该基因中至少存在一个C57BL/6J Bfsp2等位基因拷贝*Hsf4型*^-/-鼠标。**（C）**实时PCR分析SRA01/04转染HSF4b、HSF4的shRNA或HSF4b+HSF4 shRNA后Bfsp1和Bfsp2的mRNA水平。(天)启动子序列比对*Bfsp1型*和*Bfsp2*与经典热休克因子（HSE）序列相同的序列以红色显示。星号表示热休克因子结合所必需的关键核苷酸。(E类)从转染HSF4b的人晶状体上皮细胞（SRA01/04）染色质免疫沉淀富集DNA中扩增Bfsp1和Bfsp2基因启动子。(F类)用HSF4a或HSF4b转染人类晶状体上皮细胞（SRA01/04）后，启动子-荧光素酶结构体（Bfsp1-luc或Bfsp2-luc）的相对荧光酶活性。以六倍体进行转染，以Renilla荧光素酶质粒作为标准化对照。结果显示为具有标准偏差的平均值。经典HSE-luc被用作阳性对照。

图5
*Hsf4型*敲除小鼠缺乏晶状体特异性αA-晶体蛋白修饰. (A类)8周龄儿童晶状体蛋白质的双向电泳图谱*Hsf4型*^-/-和*Hsf4型*^+/+老鼠。两种2D凝胶在盒状区域存在明显差异。在*Hsf4型*^-/-和*Hsf4型*^+/+用红色圆圈指示小鼠。**（B）**A组图像中方框区域的高分辨率图像显示晶状体中翻译后修饰αA-晶体蛋白斑点的丢失*Hsf4型*^-/-老鼠。在Hsf4-/-小鼠中，2D凝胶中缺少一些αA-晶体蛋白截短片段。蛋白质通过LC/MS测序进行鉴定。箭头指向截短的αA-晶体蛋白。(C类)实时PCR检测新生儿和成人野生型和*Hsf4型*击倒老鼠。

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