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.2009年4月2日；113(14):3333-6.
doi:10.1182/bloud-2008-11-187302。 Epub 2009年2月4日。

宿主唾液酸化聚糖的分子模拟允许细菌病原体与中性粒细胞Siglec-9结合并抑制先天免疫反应

亚伦·F·卡林 1, 内山佐治, Yung-Chi Chang（永志昌）, 阿曼达·L·刘易斯, 维克托·尼泽特, 阿吉特·瓦尔基
附属公司

宿主唾液酸化聚糖的分子模拟允许细菌病原体与中性粒细胞Siglec-9结合并抑制先天免疫反应

亚伦·F·卡林等。 血液. .

摘要

人类中性粒细胞Siglec-9是一种凝集素，通过氨基末端V-set Ig结构域识别唾液酸（Sias），并在其细胞质尾部具有基于酪氨酸的抑制基序。我们假设Siglec-9将宿主Sias识别为“自我”，包括在中性粒细胞自身表面与Sias顺式相互作用，从而抑制不需要的中性粒细胞反应性。在这里，我们显示，固定化多聚Siaalpha2-3Galbeta1-4GlcNAc单元的中性粒细胞通过Siglec-9参与反式。B组链球菌（GBS）的唾液酸化荚膜多糖也呈现末端Siaalpha2-3Galbeta1-4GlcNAc单位，并且类似地与中性粒细胞Siglec-9结合，以Sia-和Siglec-9-依赖的方式抑制中性粒细胞反应。GBS唾液酸化荚膜多糖与Siglec-9的相互作用也促进了中性粒细胞氧化爆发的减少、中性粒细胞胞外DNA陷阱的形成减少以及细菌存活率的提高。因此，GBS可以通过唾液聚糖分子模拟（细菌免疫逃避的一种新机制）激活宿主抑制受体，从而损害中性粒细胞的防御功能。

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图1
图1
人中性粒细胞表面Siglec-9与唾液酸相互作用在trans中（A）中性粒细胞与固定化α2-3连接的Sias结合。用携带Siaα2-3Galβ1-4GlcNAc或Galβ1-4GlcNAc多个拷贝的聚丙烯酰胺阵列对微孔进行涂层（100μL 1 mg/mL储备液稀释为1:100；GlycoTech，马里兰州盖瑟斯堡）。加入荧光标记的中性粒细胞，让其粘附，然后冲洗掉未结合的细胞。粘附中性粒细胞的百分比通过将最终FI除以初始FI并乘以100来确定。（B） IgG抗-Siglec-9 Sia结合位点（BSAb）和Sia非结合位点（NBSAb）抗体作为功能试剂的验证；96个平板在4°C的碳酸盐缓冲液（2μg/mL）中涂上100μL蛋白A过夜。然后将重组可溶性Siglec-9-Fc嵌合体添加到100μL酶联免疫吸附测定（ELISA）缓冲液（2μg/mL）中，在4°C下过夜。洗孔，在室温下用BSAb、NBSAb或PBS预处理30分钟，然后用ELISA缓冲液洗3次。然后，将孔与生物素化的Siaα2-3Galβ1-4GlcNAc聚丙烯酰胺阵列探针在室温下孵育1小时，洗涤3次，与ELISA缓冲液中1:1000稀释的链霉亲和素碱性磷酸酶孵育，再次洗涤，并用100μL底物/孔开发孔。（C） 中性粒细胞与固定化α2-3键唾液酸结合需要Siglec-9。如A组所述，在进行结合试验之前，用BSAb、NBSAb或PBS培养中性粒细胞。（D）中性粒细胞通过Siglec-9与GBS荚膜多糖的α2-3连接Sias结合。如前所述，使用变形酶（Sigma-Aldrich，St Louis，MO）消化从GBS菌株COH1中分离出细胞壁提取物。如前所述，使用离子交换和尺寸排除色谱法从细胞壁制剂中进一步纯化CPS。纯化后的CPS与A组一样放置在微量滴定孔上。加入用BSAb或NBSAb预处理过的中性粒细胞，使其粘附，然后冲洗掉非粘附细胞。（E） 中性粒细胞通过Siglec-9与GBS细胞表面提取物结合。将未纯化的III型GBS（COH1）细胞表面提取物（包括唾液酸化CPS）固定在ELISA微孔中，并研究与BSAb或NBSAb预处理的中性粒细胞的结合，如A组所示。所有结果均代表了至少3个一式三份的实验。在30分钟的试验结束时，中性粒细胞的存活率约为85%，抗体对存活率或活化没有重大影响（数据未显示）。误差条代表SEM。
图2
图2
Siglec-9的GBS参与减弱人类中性粒细胞免疫功能（A）GBS通过Siglec-9的参与减弱中性粒细胞氧化爆发。用最终浓度为20μM的二氯荧光素二醋酸盐标记BSAb或NBSAb处理的中性粒细胞，并在37°C下培养20分钟。以10倍感染率（MOI）添加GBS COH1 WT，并在37°C下培养30分钟。使用FACS分析测量氧化突发。MFI表示平均荧光强度。（B） GBS通过Siglec-9的参与减少中性粒细胞释放颗粒蛋白酶。中性粒细胞用BSAb或NBSAb（10650μL细胞与GBS COH1细菌混合，MOI为10，一式三份），并在37°C下培养30分钟。试管在1000下离心克持续5分钟，将上清液收集到96 well板的孔中；向每个孔中添加0.5μL溶于20 mM二甲基亚砜中的MeOSuc-Ala-Ala-Pro-ValNmec。在室温下孵育20分钟后，通过405 nm处吸光度的变化以荧光分光光度法监测底物的水解。未刺激中性粒细胞释放弹性蛋白酶的基线设置为100%，图表显示了相对释放百分比。（C，D）NET的生产减弱了Siglec-9的GBS CPS参与。抗体处理的中性粒细胞与细菌在37°C的MOI 100下培养30分钟。使用Cytox Orange对NETs进行染色，并在荧光显微镜下对每个孔的中心横断面进行计数。y轴显示了每个井样带计算的净距数。（E） GBS参与Siglec-9可减弱抑制性细胞因子IL-10 mRNA表达的上调。将GBS COH1 WT添加到6孔板中MOI 10处的抗体阳性中性粒细胞中，在37°C下放置30分钟，并用反转录聚合酶链反应引物正向（AACCTCCTGCCATCAA）和反向（GGAAGACCCCCCCCCGCACAGATAG）定量IL-10 mRNA的表达。（F） Siglec-9通过其囊膜Sia的GBS结合促进了对中性粒细胞完全杀伤的抵抗。y轴显示存活率，即恢复的克隆形成单位（cfu）除以接种cfu乘以100。（G） Siglec-9通过CPS-Sia与GBS的结合促进了对中性粒细胞胞外杀伤的抵抗。总中性粒细胞和细胞外中性粒细胞杀伤试验如前所述。向经抗体处理的中性粒细胞中添加细胞分裂素D，并与GBS COH1 WT、GBS COH2δNeuA（Sia-minus）或A组混合链球菌在MOI 10下培养M1菌株，并在37°C下培养。每个样品的一部分在5、10、20和30分钟时进行电镀，第二天计算存活的细菌cfu。该图显示了30分钟时存活的cfu百分比。在其他时间点也出现了类似的差异。
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