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.2009年5月；23(4):455-63.
doi:10.1016/j.bbi.2009.01.01。 Epub 2009年1月8日。

干扰素α通过激活STAT5抑制小鼠HT22细胞糖皮质激素受体介导的基因转录

方虎 1, Thaddeus W W步调, 安德鲁·米勒
附属公司

干扰素α通过激活STAT5抑制小鼠HT22细胞糖皮质激素受体介导的基因转录

方虎等。 脑Behav Immun. 2009年5月.

摘要

干扰素（IFN）-α是一种先天性免疫细胞因子，可在临床人群中诱发显著的抑郁症状。关于干扰素-α与抑郁之间的关系，已经考虑了许多机制，包括干扰素-alpha对下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的影响。在这里，我们研究了小鼠干扰素（mIFN）-α及其信号通路对糖皮质激素受体（GR）功能的影响，GR在HPA轴调节中起关键作用。mIFN-α（100-1000IU/ml）处理HT22小鼠海马细胞24h后，可显著抑制地塞米松（DEX）诱导的GR介导的MMTV-荧光素酶活性，并显著降低DEX诱导的GR-结合到其DNA反应元件的活性。值得注意的是，mIFN-α治疗24小时对DEX诱导的GR易位或GR蛋白表达没有影响。通过药物抑制janus激酶/信号转导子和转录激活子（Jak-STAT）信号通路，而不是通过抑制p38有丝分裂原活化蛋白激酶，可以显著逆转mIFN-α对DEX诱导的GR功能的抑制。此外，用靶向STAT5而非STAT1或STAT2的siRNA预处理细胞，显著减弱了IFN-α对DEX诱导的MMTV萤光素酶活性的抑制。免疫沉淀实验显示IFN-α加DEX治疗后活化STAT5和GR的核共免疫沉淀。综上所述，这些结果表明，IFN-α对海马HT22细胞GR功能的负调控是通过激活Jak/STAT信号通路介导的，从而导致核STAT5-GR蛋白-蛋白质相互作用。鉴于GR在抑郁症中的作用，IFN-α对海马来源细胞GR功能的影响可能导致IFN-α治疗患者HPA轴的改变和抑郁症状。

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数字

图1
图1。mIFN-α抑制地塞米松诱导的HT22细胞荧光素酶活性
HT22细胞在12孔培养板中生长，直至80%融合。在无血清培养基中使用脂蛋白试剂和pAH-Luc质粒进行瞬时转染。然后用载体处理细胞24小时，mIFN-alpha（100或1000 U/ml）处理细胞24 h，载体处理细胞22小时，然后用载体加DEX（50nM）处理细胞2小时，或用mIFN-alpha（100%或1000 U/ml）处理细胞22 h，然后用mIFN-alpha加DEX处理细胞2 h。对所有样品进行了一式三份的分析，所示值代表从三个独立实验中获得的观察值的平均值（±SEM）。如前所述测量荧光素酶活性。*与相同DEX治疗组FLSD中的中等剂量组相比，p<0.05。
图2
图2。mIFN-α降低地塞米松诱导的HT22细胞GR-GRE结合
面板A：细胞在100 mm培养皿中生长，直至100%融合。用载体处理细胞24小时，mIFN-alpha（1000 U/ml）处理细胞24个小时，载体处理细胞22小时，然后用载体加DEX（50nM）处理细胞2小时，或用mIFN-alpha（1000U/ml，22小时）处理细胞，然后用mIFN-alpha加DEX处理细胞2个小时。然后分离核提取物，并使用来自每个处理条件的10μg核蛋白进行凝胶迁移率变化分析32P标记的合成双链GRE寡核苷酸。图中显示了具有代表性的凝胶。B组：所示数据表示从三个独立实验中获得的平均±SEM光密度，以控制百分比表示（车辆状况）。*与车辆控制相比p<0.05，**p<0.05与单独使用DEX相比。
图3
图3。mIFN-α治疗1、5、12和24小时并不会降低HT22细胞中GR蛋白的全细胞表达
细胞在6孔培养板中生长，直至80%融合，然后用载体或mIFN-alpha（1000 U/ml）处理24小时，处理时间如图所示。western blot检测全细胞GR。面板A：所示值表示三个独立实验中GR蛋白的平均（±SEM）光密度，表示为对照组的百分比（车辆条件）。B组：显示了在所示mIFN-α处理后GR蛋白表达的代表性印迹。
图4
图4。mIFN-α不能减弱HT22细胞GR的核转位
面板A：细胞在添加10%FBS的DMEM中生长汇合。用载体处理细胞24小时，mIFN-alpha（1000 U/ml）处理细胞24个小时，载体处理细胞22小时，然后用载体加DEX（50nM）处理细胞2小时，或用mIFN-alpha（1000U/ml，22小时）处理细胞，然后用mIFN-alpha加DEX处理细胞2个小时。使用针对GR产生的抗体对细胞核和胞质提取物进行蛋白质印迹分析。显示了胞质和核蛋白提取物的代表性印迹。B组：所示值表示三个独立实验中GR蛋白的平均（±SEM）光密度，表示为对照组的百分比（车辆条件）。*与同一隔间内的车辆对照组相比，p<0.05。面板C：在实验治疗开始前，将转染GR-绿色荧光蛋白（GFP）嵌合体的细胞在含有煤焦剥离血清的DMEM中培养16小时。然后用载体处理细胞24小时，mIFN-alpha（1000 U/ml）处理24小时，载体处理23小时，然后用载体加DEX（50nM）处理1小时，或mIFN-alpha（1000U/ml。GR-GFP荧光图像描绘了具有代表性的细胞。
图5
图5。抑制Jak-STAT信号而非p38 MAPK信号逆转mIFN-α诱导的DEX诱导的MMTV荧光素酶活性变化
面板A：稳定转染MMTV-核糖核酸酶报告基因构建物的HT22细胞在12孔培养板中生长，直至80%融合。然后，在存在或不存在Jak抑制剂I（0.01–1.0μM）或SB203580（1–20μM）浓度增加的情况下，用载体处理细胞24小时，mIFN-α处理细胞24个小时，载体处理细胞22个小时，然后用载体加DEX（50nM）处理细胞2小时，或用mIFN-阿尔法（1000 U/ml）处理细胞22小时，然后再用IFN-α加DEX处理细胞2个小时。对所有样品进行了一式三份的分析，所示值代表从三个独立实验中获得的观察值的平均值（±SEM）。如前所述测量荧光素酶活性。*与单独使用DEX的细胞相比，p<0.05；**与mIFN-alpha加DEX处理的细胞相比，p<0.05。
图6
图6。针对STAT5而非STAT1或STAT2的siRNA逆转mIFN-α对地塞米松诱导的HT22细胞MMTV-核糖核酸酶活性的抑制
面板A。细胞在60mm培养皿中生长，直至80%融合。用100 nM靶向STAT1、STAT2或STAT5的siRNA瞬时转染细胞24小时，或用非靶向siRNA转染细胞，然后用MMTV-核糖核酸酶报告结构转染细胞。转染后，用载体处理细胞24小时，mIFN-alpha（1000 U/ml）处理细胞24个小时，载体处理细胞22小时，然后用载体加DEX（50 nM）处理细胞2小时，m干扰素-alpha处理细胞22个小时，然后再用mIFN-alpha加DEX处理细胞2个小时。所示值代表从三个独立实验中获得的观察值的平均值（±SEM）。*与单独使用DEX的细胞相比，p<0.05；**与mIFN-alpha加DEX治疗的细胞相比，p<0.05。
图7
图7。在没有mIFN-α治疗的情况下，siRNA对STAT5蛋白表达的抑制不会改变DEX诱导的MMTV-核糖核酸酶活性
面板A：HT22细胞在12孔培养板中生长，直至80%融合。然后用100 nM针对STAT5的siRNA瞬时转染细胞24小时，或用非靶向siRNA转染细胞，然后用MMTV-核糖核酸酶报告体转染细胞。转染后，用载体处理细胞24小时，mIFN-alpha（1000 U/ml）处理细胞24个小时，载体处理细胞22小时，然后用载体加DEX（50 nM）处理细胞2小时，m干扰素-alpha处理细胞22个小时，然后再用mIFN-alpha加DEX处理细胞2个小时。所示值代表从三个独立实验中获得的观察值的平均值（±SEM）。*与单独使用DEX的细胞相比，p<0.05；**与mIFN-alpha加DEX治疗的细胞相比，p<0.05。
图8
图8。干扰素-α和地塞米松处理HT22细胞后，STAT5和GR参与蛋白质相互作用
图像是三个独立实验的代表。用载体、mIFN-alpha（1000 U/ml）或mIFN-alpha加DEX（50 nM）处理30分钟的细胞生成核提取物，并使用带有抗GR抗体的蛋白A或蛋白G-淀粉珠进行免疫沉淀。然后使用10%Tris-HCl凝胶将蛋白质溶解，电泳转移到硝化纤维素膜上，并用抗p-STAT5或抗GR抗体进行印迹。
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