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。2009年2月3日；106(5):1398-403.
doi:10.1073/pnas.0808584106。 Epub 2009年1月21日。

信号锚定序列刺激信号识别粒子从出口通道内与核糖体结合

尤塔·伯恩特 1, 斯特凡·奥勒, 张颖（音）, 亚瑟·E·约翰逊, 萨宾·罗斯伯特
附属公司

信号锚定序列刺激信号识别粒子从出口通道内与核糖体结合

尤塔·伯恩特等。 美国国家科学院程序。 。

摘要

真核细胞膜和分泌蛋白的分类取决于信号识别颗粒（SRP）对核糖体结合的新生链信号序列的识别。目前的模型表明，当信号序列从核糖体隧道中出现并与SRP结合时，SRP循环开始。然后延长速度减慢，直到SRP结合的核糖体上升链复合物（RNC）靶向内质网（ER）膜中的SRP受体。然后RNC被转移到translocon，SRP被释放，翻译恢复。由于RNC在新生链过长的情况下不会有效地瞄准转座子，因此SRP识别其底物的窗口很短。我们现在发现，跨膜信号锚定序列（SA）显著增强了SRP与RNC的结合，甚至在SA从核糖体隧道中出现之前。在这种模式下，SRP不直接接触SA，而是与已经离开核糖体隧道的新生多肽部分非常接近。SRP的早期招募为扩大底物鉴定窗口提供了一种机制。我们认为，SRP-核糖体相互作用的动力学不仅受到SRP与暴露的信号序列的直接结合的影响，还受到从隧道内触发的翻译核糖体的特性的影响。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
Dap2暴露的SA吸引SRP，不利于其他核糖体相关蛋白生物发生因子与RNCs的结合。(A类)120 aa的新生Pgk1和54、60和120 aa Dap2的示意图。II型膜蛋白Dap2包含定位于氨基酸30和45之间的SA。SA显示为深灰色；核糖体隧道覆盖的新生链部分以浅灰色表示。新生链含有一个用于RNC纯化的N末端FLAG标签。赖氨酸的位置对化学交联很重要，标记为黑色条。(B类)Dap2和突变型Dap2TM和Dap2α的SA。(C类)Dap2-120或Pgk1-120 RNC的占用率，RPB占RNC的百分比。误差条表示平均值的标准误差（SEM）。(D类)用于定量Dap2-120 RNC上Srp54、αNAC、Ssb1/2和Nat1的免疫印迹例证了C类携带FLAG标记的新生Dap2的RNC通过使用αFLAG包被珠的天然免疫沉淀分离。用免疫印迹法分析回收和纯化的标准蛋白的等分样品。将从同一个凝胶暴露中获得的信号装箱。在标准情况下，通道上方的数字分别给出了皮摩尔凝胶或飞沫凝胶中各自纯化蛋白的含量。用总酵母提取物补充标准蛋白质His-Rps9a，以确保程序期间的定量回收。标准曲线(图S2)用于确定RNC的数量和通过FLAG标记的新生链拉下的附加因子。减去来自相同处理样品的背景，该样品含有携带相同但未标记的新生链的RNC。样品中His-Rps9a的量除以与先前测定的核糖体蛋白质平均值（参考文献和图S2)。
图2。
图2。
RPB与新生链的相互作用。(A类)35携带未标记新生链的S标记RNC通过含有120 mM醋酸钾（pH 7.4）的蔗糖垫离心分离，然后在没有蔗糖垫的情况下培养（TOT−BS三)或存在（TOT+BS三)均双功能交联剂BS三.含有4倍于TOT+BS材料的等分试样三样品在变性条件下用针对Ssb1、Srp54、α/βNAC或Nat1的抗体进行免疫沉淀（IP）。样品在Tris-Tricine凝胶上运行，随后通过放射自显影术进行分析。(B类)低盐或高盐处理后SRP与RNC的相互作用。实验按照中所述进行A类除此之外，携带FLAG标记的新生链的RNC被分离出来，尽管蔗糖垫含有120 mM或550 mM醋酸钾。Ssb1/2用作对照，因为它在用550 mM醋酸钾处理RNC后不再形成交联。星号表示相关的交联。
图3。
图3。
核糖体隧道内Dap2的SA增强SRP与核糖体的结合。(A类)低盐浓度（120 mM醋酸钾）下携带不同长度新生Dap2、Dap2TM、Dap2α或Pgk1的RNC的SRP占有率。连字符后面是新生链中的氨基酸数量，不包括FLAG标签。误差条表示SEM。分析和量化如图1所示D类和图S2. (B类)Dap2TM和Dap2α失去了与SRP相互作用的能力，并获得了与Ssb1相互作用的功能。与BS交叉链接三如图2所示进行A类通过含有120 mM醋酸钾的蔗糖缓冲液分离后，携带FLAG-标记的120-残留新生Dap2、Dap2TM、Dap2α和Pgk1的RNC。如图所示，使用αSrp54或αSsb1进行免疫沉淀。Srp54-CL：新生链和Srp54之间的交联；Ssb1-CL：新生链和Ssb1/2之间的交联。
图4。
图4。
SRP接近新生链，Dap2 SA位于隧道内，但需要SA暴露以进行抗盐结合。(A类)在高盐浓度（550 mM醋酸钾）下分离后，携带60个残基Pgk1或60个和120个残基新生Dap2的RNC的SRP占有率。误差条表示SEM。分析和量化如图1所示D类. (B类)SRP与标记为54、60和120的新生Dap2、Dap2TM或Dap2α的FLAG的相互作用。(C类)SRP和NAC与FLAG标记的新生Dap2-54或Dap2α-54的相互作用。交叉链接产品标有星号。与BS交叉链接三交联产物的分离如图2所示A类。
图5。
图5。
核糖体隧道内的Dap2 SA与SRP不相邻。(A类)描述了具有54、60和120个残留Dap2新生链的RNC，在SA序列的中间有一个光探针。(B类)35用εANB-Lys探针在120残余长度的第39位FLAG-Dap2或FLAG-Dap2α光解S-蛋氨酸标记的RNC（+UV）。作为对照，平行样品未被紫外线（−UV）照射。然后通过FLAG标签分离RNC，并通过放射自显影术进行分析。Dap2-120和Srp54之间的交联用星号标记。(C类)35在新生FLAG-Dap2的39位用εANB-Lys探针标记的S-蛋氨酸标记的RNCs被光解（+UV）或保持在黑暗中（−UV），然后通过FLAG标签分离。在变性条件下，使用αSrp54偶联到蛋白A Sepharose珠（IPαSrp54。(D类)SRP绑定到RNC的三阶段模型。第一阶段：SRP（绿色）与翻译核糖体（灰色）弱结合。这种相互作用模式与新生链（浅蓝色）的长度和类型无关，但SRP亲和力高于非翻译核糖体。第二阶段：SA合成后，与核糖体的相互作用增强，SRP定位于新生多肽的暴露部分附近。这种相互作用对盐敏感，这表明它在自然界中主要是静电作用。第三阶段：当SA从隧道中出现时，SRP以高亲和力与之结合。这种相互作用现在是耐盐的，因此表明疏水性相互作用有很大的作用。在此阶段，翻译被阻止，RNC–SRP复合物靶向ER膜中的SRP受体。有关详细信息和参考，请参阅讨论。
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